Verfügbarkeit: Einzelmolekülmikroskopie zur Charakterisierung von Transkriptionsfaktor-Chromatin-Interaktionen im Zebrafisch

Einzelmolekülmikroskopie zur Charakterisierung von Transkriptionsfaktor-Chromatin-Interaktionen im Zebrafisch:

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
Beteilige Person:	Reisser, Matthias (VerfasserIn)
Format:	Hochschulschrift/Dissertation Buch
Sprache:	Deutsch
Veröffentlicht:	Ulm 2020
Schlagwörter:	Einzelmolekülmikroskopie Chromatin Zebrabärbling Transkriptionsfaktor Freies Molekül Hochschulschrift
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adam_text	INHALTSVERZEICHNIS 1 ABSTRACT 1 2 EINLEITUNG 3 I GRUNDLAGEN 5 3 GRUNDLAGEN DER MOLEKULAREN GENETIK UND ENTWICKLUNGSBIOLOGIE 7 3.1 DAS ZENTRALE DOGMA DER MOLEKULARBIOLOGIE ....................................... 7 3.2 DIE REGULATION DER TRANSKRIPTION ......................................................... 8 3.2.1 KOMPAKTIERUNG DER DNA ......................................................... 8 3.2.2 PHASEN DER TRANSKRIPTION ........................................................ 11 3.2.3 TRANSKRIPTIONSINITIATION .............................................................. 12 3.3 PHYSIKALISCHE GESETZMAESSIGKEITEN DER GENREGULATION ........................ 14 3.3.1 BIMOLEKULARE GLEICHGEWICHTSREAKTIONEN ................................. 14 3.4 GENREGULATION IN FRUEHEN STADIEN DER EMBRYONALENTWICKLUNG ............ 17 4 GRUNDLAGEN DER EINZELMOLEKUELMIKROSKOPIE 21 4.1 FLUORESZENZMIKROSKOPIE .................................................................... 22 4.1.1 DIE FLUORESZENZ EINZELNER MOLEKUELE ....................................... 22 4.1.2 MIKROSKOPISCHES AUFLOESUNGSVERMOEGEN .................................... 25 4.1.3 BELEUCHTUNGSGEOMETRIEN ......................................................... 26 4.1.4 LICHTBLATTMIKROSKOPIE .............................................................. 28 4.2 EINZELMOLEKUELDETEKTION ....................................................................... 29 4.2.1 EINZELMOLEKUELLOKALISATION ......................................................... 32 4.3 ANALYSE VON EINZELMOLEKUEL-TRAJEKTORIEN ............................................. 33 4.3.1 ANALYSE VON SPRUNGWEITENVERTEILUNGEN ................................. 34 4.3.2 ANALYSE VON AUFENTHALTSDAUERN ................................................ 34 INHALTSVERZEICHNIS II MATERIAL UND METHODEN 37 5 AUFBAU DES RLS-MIKROSKOPS, DATENERFASSUNG UND DATENANALYSE 39 5.1 OPTISCHE UND MECHANISCHE KOMPONENTEN DES AUFBAUS ..................... 39 5.2 VERWENDETE BAUTEILE ........................................................................... 39 5.3 WELLENLAENGEN DES AUFBAUS .................................................................. 43 5.4 PRAEPARATION DES MIKROSPIEGELS ............................................................ 47 5.5 MESSUNGEN IN HILO-GEOMETRIE ............................................................ 48 5.6 DATENERFASSUNG UND -ANALYSE ............................................................... 49 5.6.1 PHOTONENRATEN UND LOKALISATIONSPRAEZISION .............................. 49 5.6.2 TIME-LAPSE-RLS-MIKROSKOPIE ................................................ 49 5.6.3 ITM AM RLSM ........................................................................... 51 6 BIOLOGISCHE UND BIOCHEMISCHE METHODEN 53 6.1 VERWENDETE MATERIALIEN ........................................................................ 53 6.2 PRODUKTION UND NUTZUNG VON ZEBRAFISCHEMBRYONEN ........................... 57 6.2.1 EMBRYONENERNTE UND DECHORIONIERUNG .................................... 59 6.2.2 NADELVORBEREITUNG, INJEKTION UND BEHANDLUNG ........................ 59 6.2.3 STADIENBESTIMMUNG .................................................................. 60 6.3 ZELLKULTUR UND VORBEREITUNG DER ZELLEN ................................................ 60 6.4 BIOCHEMISCHE METHODEN ..................................................................... 61 6.4.1 CHLP-QPCR .............................................................................. 61 6.4.2 PROTEINGEWINNUNG UND WESTERNBLOT .......................................... 63 6.4.3 PRODUKTION DER VERWENDETEN MRNA ....................................... 64 III ERGEBNISSE 67 7 EINZELMOLEKUELMIKROSKOPIE IN LEBENDEN ZEBRAFISCH-EMBRYONEN 69 7.1 HARDWARESEITIGE INNOVATIONEN ............................................................ 70 7.1.1 BILDGEBUNG IM ZEBRAFISCHEMBRYO ............................................. 73 7.2 DATENERHEBUNG MITTELS ITM .................................................................. 73 7.2.1 FUNKTIONSWEISE UND ROHDATEN ................................................ 76 7.2.2 MATHEMATISCHE KORREKTUR ......................................................... 77 7.3 DISKUSSION ............................................................................................. 78 VI INHALTSVERZEICHNIS 8 TF-CHROMATIN-INTERAKTIONEN WAEHREND DER ZGA 81 8.1 KONTROLLEXPERIMENTE ............................................................................. 81 8.1.1 CHLP-QPCR-EXPERIMENTE ................................ 81 8.1.2 WESTERNBLOT .................................................... 83 8.1.3 STADIENBESTIMMUNG ........................................ 85 8.2 BINDUNGSZEITANALYSE AN MEOS2-TBP UND SOX19B .............................. 87 8.2.1 ERGEBNISSE ....................................................... 87 8.3 DIE GEBUNDENE FRAKTION VON TF ......................................................... 90 8.3.1 DIE GEBUNDENE FRAKTION ZEIGT KEINE KONZENTRATIONSABHAENGIGKEIT 90 8.3.2 DIE GEBUNDENE FRAKTION STEIGT IM VERLAUF DER ENTWICKLUNG . . 93 8.4 DIE GEBUNDENE FRAKTION STEIGT MIT SINKENDEM ZELLKERNVOLUMEN .... 96 8.4.1 EIN MODELL ZUR TF-BINDUNG AN ZWEI ARTEN VON BINDUNGSSTELLEN 97 8.4.2 DIE GEBUNDENE FRAKTION AN TFS ............................................. 99 8.5 DIE WIRKUNG DES SCHRUMPFENDEN ZELLKERNVOLUMENS .............................. 101 8.5.1 EINFLUSS AUF KONZENTRATIONEN ........................... 101 KONZENTRATION MARKIERTER TRANSKRIPTIONSFAKTOREN IM ZELLKERN . 101 KONZENTRATION VON CHROMATIN-BINDUNGSSTELLEN IM ZELLKERN . . 101 ABHAENGIGKEIT DER GEBUNDENEN FRAKTION Q VOM ZELLKERNVOLUMEN102 8.5.2 DIE RELATIVE SCHEINBARE ANZAHL VON CHROMATIN-BINDUNGSSTELLEN 103 INJEKTION VON TSA OEFFNET DAS CHROMATIN .................................... 104 8.6 DISKUSSION ............................................................................................... 108 9 ANALYSEMETHODE ZUR BESTIMMUNG VIELER RATEN 113 9.1 PROBLEME DER KLASSISCHEN MULTI-EXPONENTIELLEN ANALYSE UND DAS AR BEITSPRINZIP VON GRID ..................................................................... 113 9.2 MATHEMATISCHE FORMULIERUNG ................................................................. 114 9.3 TESTS VON GRID AN SIMULIERTEN DATENSAETZEN .......................................... 118 9.4 ANWENDUNG VON GRID AUF EINZELMOLEKUELMESSUNGEN ........................... 120 9.5 ZUR BEDEUTUNG DER RATENSPEKTREN ........................................................ 124 9.5.1 DAS RATENSPEKTRUM ALS MASS DER INTERAKTIONSHAEUFIGKEIT .... 124 9.5.2 DAS RATENSPEKTRUM BEI HOMOGENER BINDERATE ........................ 126 9.5.3 VOM RATENSPEKTRUM ZUR ZUSTANDSWAHRSCHEINLICHKEIT ............ 126 9.5.4 AUFTRAGUNG DER FRAKTIONEN UEBER DIE ABLOESEENERGIE ............... 128 9.6 DISKUSSION ............................................................................................... 132 VII INHALTSVERZEICHNIS IV ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 135 V ANHANG 141 A KORREKTUR DER ITM-ROHDATEN 143 A.0.1 KLASSIFIKATION DER MOLEKUELE MIT OPTIMIERTEM BELEUCHTUNGSSCHE MA .................................................................................... 143 A.0.2 DAS VERHAELTNIS R KANN AUS DER BINDUNGSZEITENVERTEILUNG BE RECHNET WERDEN ............................................................... 144 BINDUNGSZEITENVERTEILUNG FLUORESZENTER MOLEKUELE BEI ITM ... 144 TRAJEKTORIEN MIT UNTERSCHIEDLICHEN STARTPUNKTEN ........................ 146 A.0.3 KORREKTUR DES ANTEILS ALLER GEBUNDENER MOLEKUELE ..................... 148 B VERWENDETE NUKLEOTIDSEQUENZEN 151 C QUELLTEXTE 153 0.1 ANSTEUERUNG DES MIKROSKOPS ................................................................ 153 0.1.1 TIME-LAPSE-MESSUNGEN ............................................................ 155 0.1.2 ITM-MESSUNGEN ........................................................................... 156 0.2 EINZELMOLEKUELMESSUNGEN IN ZEBRAFISCHEMBRYONEN ............................. 157 LITERATUR 173 VIII
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