Methoden der Mikrobiologie: ein Praxishandbuch
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Vil Inhaltsverzeichnis 1 Isolierung und Kultivierung von Bakterien. 1 Astrid Brandis-Heep 1.1 Anreicherung von Bakterien aus einer Bodenprobe. 1.1.1 Anreicherung von Bacillus subtilis. 1.1.2 Kultivierung von Bacillus subtilis auf Minimalmedium. 1.1.3 Anreicherung von Clostridiumpasteurianum. 3 3 7 9 1.2 Anreicherung aus einer Wasserprobe. 1.2.1 Anreicherung von Escherichia coli. 1.2.2 Kultivierung von Escherichia coli auf Minimalmedium. 11 11 13 1.3 Spezielle Verfahren bei der anaeroben Anreicherung. 1.3.1 Spezielle Gefäße und Verschlüsse für die Anaerobentechnik. 1.3.2 Medienherstellung für die Kultivierung anaerober Bacteria und Archaea. 15 15 15 1.4 Isolierung anoxygener phototropher Bakterien. 1.4.1 Winogradski-Säule. 1.4.2 Anreicherung grüner Schwefelbakterien (z. B. Chlorobium). 1.4.3 Anreicherung von Schwefelpurpurbakterien (z. B. Chromatium). 1.4.4 Anreicherung von Nicht-
Schwefelpurpurbakterien. 27 27 29 30 32 1.5 1.5.1 1.5.2 1.5.3 Direktisolierung von Bakterien. Verdünnung einer Schlamm-oder Wasserprobe. Verdünnungsreihe für aerobe Bakterien. Verdünnungsreihe für anaerobe Bakterien (Agar Shake). 33 33 34 35 1.6 1.6.1 1.6.2 1.6.3 1.6.4 Gewinnung von Reinkulturen. Vereinzelung durch Drei-Strich-Technik. Vereinzelung durch Kreuzstrich. Flächenausstrich mit dem Drigalski-Spatel. Vereinzelung aerotoleranter anaerober Bakterien. 39 39 42 43 44 1.7 1.7.1 1.7.2 1.7.3 1.7.4 Bestimmung von Wachstum. Bestimmung der (Gesamt-)Zellzahl mit der Zählkammer. Bestimmung der Zellzahl mit der Membranfiltertechnik. Bestimmung der Lebendzellzahl. Bestimmung der Zellmasse. 45 45 47 52
57 Identifizierung und Differenzierung von Bakterien. 63 2 Astrid Brandis-Heep 2.1 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.1.4 2.1.5 Morphologische Eigenschaften von Bakterien. Zellwand: KOH-Test. Zellwand: Gram-Färbung. Nachweis von Endosporen. Test auf Beweglichkeit von Bakterien. Kapseldarstellung. 65 65 66 69 70 72
VIII Inhaltsverzeichnis 2.2 2.2.1 2.2.2 Physiologische Eigenschaften von Bakterien: Nachweis auf Identifizierungsmedien. 73 Eosin-IVlethylenblau-Agar (EMB-Agar). 73 MacConkey-Agar. 75 2.2.3 2.2.4 2.2.5 2.2.6 Nachweis des oxidativen/fermentativen Abbaus von Zuckern (OF-Test). 76 Methylrot-Test: Säure- und Gasbildung. 78 Citrat-Agar - Citratlyase. 79 SIM-Agar, MIO-Agar, MIL-Agar. 82 2.3 Physiologische Leistungen: Nachweis von Enzymaktivitäten. 2.3.1 2.3.2 2.3.3 2.3.4 2.3.5 2.3.6 2.3.7 Nachweis der Katalase-Aktivität. 87 Nachweis der Cytochrom-c-Oxidase-Aktivität. 87 Nachweis von Indol: Tryptophanase-Aktivität. 89 Nachweis von Acetoin (Voges-Proskauer-Test). 90 Nachweis der Urease-Aktivität. 90
Nachweis der Lysin-Deaminase und -Decarboxylase-Aktivität. 92 Nachweis der Phenylalanin-Deaminase-Aktivität. 94 87 2.3.8 2.3.9 2.3.10 2.3.11 2.3.12 2.3.13 Nachweis der Gelatinase-Aktivität. 95 Nachweis der Amylase-Aktivität. 97 Nachweis der Cellulase-Aktivität. 99 Nachweis der Nitrat-und Nitritreduktase-Aktivität. 101 Nachweis von Hämolysin-Aktivität. 104 Multitestsystem. 105 3 Pilze. 107 Erika Kothe 3.1 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 Isolierung und Kultivierung von Hefen und filamentösen Pilzen. Hefen. Kultivierung filamentöser Pilze in Flüssigmedien. Kultivierung filamentöser Pilze auf festen
Medien. Isolierung von Pilzen aus flüssigen Umweltproben. 109 109 112 114 117 3.1.5 3.1.6 3.1.7 3.1.8 Isolierung von Pilzen aus Bodenproben. Isolierung von Pilzen aus Fruchtkörpern. Isolierung von Pilzen aus Pflanzenmaterial. Stammhaltung von Pilzen. 119 121 123 126 3.2 Identifizierung von Pilzen durch mikroskopische und DNA-abhängige Methoden. 3.2.1 Mikromorphologische Bestimmung. 3.2.2 Färbungen zur Beobachtung von Zellkompartimenten in Pilzen. 3.2.3 Bestimmung von Pilzen durch parasitische bzw. symbiontische Stadien. 3.2.4 Bestimmung von Pilzen durch Sequenzierung der ITS-Region. 128 128 130 133 136 3.3 3.3.1 3.3.2 Untersuchungen zu Lebenszyklen von Pilzen. 138 Lebenszyklus und Zellzyklus bei Saccharomyces cerevisiae. 138 Hefen und der Übergang zu Hyphenformen. 141 3.3.3 Entwicklung asexueller
Sporen. 144
IX Inhaltsverzeichnis 3.3.4 3.3.5 3.3.6 3.3.7 Nachweis der Einflüsse von Licht, Tagesrhythmen und Kreuzung bei der Bildung asexueller Sporen. Kreuzung bei Basidiomyceten am Beispie! von Schizophyllum commune. Pilzkulturen und Fruchtkörperbildung bei Basidiomyceten. Kreuzung filamentöser Ascomyceten am Beispiel von Aspergillus nidulans. 3.3.8 Tetradenanalyse bei Sordaria fimicola. 155 3.4 3.4.1 Lokalisierungen von Proteinen und Zellkomponenten in situ. 157 Färbungen für den Nachweis von Enzymen und Naturstoffen. 157 3.4.2 3.4.3 3.4.4 Immunologischer Nachweis von Proteinen. 161 Fluoreszenz-Videomikroskopie bei Pilzen. 163 Separieren unterschiedlicher Zellkompartimente. 166 3.5 3.5.1 Transformationssysteme in Pilzen. 168 Vektoren und Stabilität der Transformation. 168 3.5.2 3.5.3 LiCI-basierte Transformation. 170 Elektroporation von Conidiosporen. 171 3.5.4 3.5.5 PEG-
vermittelte Transformation bei Schizophyllum commune. 173 Agrobacterium fumerariens-vermittelte Transformation beim Ektomykorrhizapilz Tricholoma vaccinum. 175 4 Molekularbiologische Methoden. 179 146 149 151 153 Erika Kothe 4.1 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5 4.2 Isolierung und Analyse von Nukleinsäuren. Isolierung von Gesamt-DNA aus Reinkulturen und Umweltproben. Isolierung von Plasmid-DNA. Isolierung von RNA. Konzentrationsbestimmung für Nukleinsäuren. Agarose-Gelelektrophorese. 181 181 182 183 185 186 Isolierung und Analyse von Proteinen. 188 4.2.1 4.2.2 4.2.3 Herstellung von Proteinextrakten für die SDS-Gelelektrophorese. 188 Quantifizierung von Proteinen. 189 Proteingelelektrophorese. 189 4.3 4.3.1 DNA-modifizierende
Enzyme. 192 Restriktionsendonukleasen. 192 4.3.2 4.3.3 Vektoren und Klonierung. 193 Elektroporation von Escherichia coli. 195 4.4 Nachweis von Nukleinsäuren und Proteinen durch Hybridisierung und Antikörper-abhängige Methoden. 196 4.4.1 4.4.2 4.4.3 4.4.4 Southernblot-Analyse. Northernblot-Analyse. Westernblot-Analyse. Enzyme-linked Immuno-Sorbent-Assay (ELISA). 4.5 4.5.1 Nachweismethoden durch Polymerase-Kettenreaktion. 203 Genspezifische Polymerase-Kettenreaktion (PCR). 203 4.5.2 PCR zum Nachweis von Transkripten (RT-PCR). 205 196 199 200 201
X Inhaltsverzeichnis 4.53 Quantitative real-time-PCR (qPCR). 206 4.6 4.6.1 Sequenzierung und Genanalyse. 208 4.6.2 4.6.3 Homologiesuche mit BLAST. 209 Stammbaumerstellung. 211 Sequenzierung, Mikrobiomanalyse, Metagenom, Transkriptom. 208 Lichtmikroskopische Methoden. 213 5 Timo Zimmermann 5.1 5.1.1 Das Lichtmikroskop: Funktion und Komponenten. 216 Objektive, Vergrößerung und Auflösung. 217 5.2 5.2.1 5.2.2 5.2.3 Durchlichtmikroskopie. Köhler'sche Beleuchtung. Phasenkontrast. Differenzialinterferenzkontrast. 5.3 5.3.1 5.3.2 5.3.3 5.3.4 Fluoreszenzmikroskopie. 229
Epifluoreszenzmikroskopie. Digitale Bilderfassung. Konfokale Mikroskopie. Lichtmikroskopie jenseits der Beugungsgrenze (Superauflösende Fluoreszenzmikroskopie). 222 223 224 226 230 234 237 239 5.4 5.4.1 5.4.2 PräparationsmethodenfürdieMikroskopie. 240 5.5 5.5.1 Lebendfärbungen für die Durchlichtbetrachtung. 250 Tuschepräparat für den Kapselnachweis. 251 5.5.2 5.5.3 5.5.4 Negativfärbungen. 252 Vitalfärbung mit Methylenblau. 253 Färbung von Speicherstoffen. 254 5.6 Färbungen fixierter Proben für die Durchlichtbetrachtung. 256 5.6.1 5.6.2 Einfach-Färbungen. 258
Differenzialfärbungen. 261 5.6.3 Strukturfärbungen. 268 5.7 5.7.1 Färbungen für die Fluoreszenzbetrachtung. 277 5.7.2 5.7.3 5.7.4 Bleichschutz. 281 Fluoreszenzfärbungen fixierter Proben. 282 Einbettungen und Bleichschutz. 284 Herstellung lebender Proben. 240 Herstellung fixierter Proben. 244 Fluoreszenzlebendfärbungen. 278 Serviceteil. 287 Stichwortverzeichnis. 289 |
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