Falling upwards: how we took to the air
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| Format: | Buch |
| Sprache: | Englisch |
| Veröffentlicht: |
London
William Collins
2014
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| Ausgabe: | William Collins paperback edition |
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| Umfang: | XII, 404 Seiten Illustrationen, Karten 24 cm |
| ISBN: | 9780007476510 0007476515 |
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 T-ZELL-IMMUNTHERAPIE 1
1.2 RISIKEN DES TZR-GENTRANSFERS DURCH OFF TERGEF -ZIELUNGERICHTETE
REAKTIONEN 5
1.3 GESTALTUNG VON TZR-KONSTRUKTEN 8
1.4 OPTIMIERUNGSPROZESSE ZUR FOERDERUNG DER EXPRESSION UND FUNKTIONALITAET
EINES TZR 12
1.5 KLASSIFIZIERUNG VON TUMOR-ASSOZIIERTEN ANTIGENEN (TAA) 13
1.6 PP65 4 95.503-VIRUS-SPEZIFISCHE / TUMORANTIGEN- UND PP65 4
95-503-BI-SPEZIFISCHE
T-ZELLEN FUER DEN ADOPTIVEN TZR-TRANSFER 16
1.7 ZIELE DER UNTERSUCHUNG 19
2 MATERIALIEN 20
2.1 CHEMIKALIEN 20
2.2 SUBSTANZEN UND MEDIEN FUER DIE ZELLKULTUR 21
2.3 ZELLKULTURMEDIEN 22
2.3.1 KOMPLETTES RPMI ZUR KULTIVIERUNG VON HUMANEN ZELLLINIEN
(10 % RPMI) 22
2.3.2 KOMPLETTES RPMI ZUR KULTIVIERUNG VON HUMANEN PBMZ UND
CMVSPEZIFISCHEN T-ZELLEN (HU RPMI) 23
2.3.3 KOMPLETTES DMEM ZUR KULTIVIERUNG VON VERPACKUNGSZELLLINIEN/
PHOENIX-ZELLLINIEN (10 % DMEM) 23
2.3.4 KOMPLETTES RPMI ZUR KULTIVIERUNG DER MURINEN
T-ZELLHYBRIDOMZELLLINIE 58 A SS CD3 23
2.4 MEDIUM ZUR KRYOKONSERVIERUNG VON ZELLEN 24
2.5 PEPTIDE 24
2.6 SUBSTANZEN FUER DIE BAKTERIENKULTUR 24
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
2.6.1 LB-MEDIUM ZUR KULTIVIERUNG VON BAKTERIENKULTUREN 25
2.6.2 LB-PLATTEN ZUR KULTIVIERUNG VON BAKTERIENKULTUREN 25
2.7 KOMMERZIELLE VERSUCHSSYSTEME 25
2.7.1 PUNKTMUTAGENESE-PCR 25
2.7.2 PLASMID-EXTRAKTION 25
2.7.3 DNS-AUFREINIGUNG 26
2.7.4 DNS-MARKER ZUR GELELEKTROPHORESE 26
2.7.5 TRANSFEKTIONSREAGENZIEN 26
2.7.6 ELISA 26
2.7.7 INTRAZELLULAERE FAERBUNG UND INTRAZELLULAERE ZYTOKIN-FAERBUNG 26
2.7.8 ANALYSE DER SUBFAMILIENZUGEHOERIGKEIT DER TZRSS-KETTEN VON
HUMANEN T-ZELLEN 27
2.7.9 CD8 POSITIVE MAGNETISCHE AUFREINIGUNG 27
2.8 ENZYME 27
2.9 VEKTOREN 27
2.9.1 AUFLISTUNG DER VERWENDETEN DOPPELKETTEN-TZR KONSTRUKTE 29
2.10 ANTIKOERPER FUER DIE DURCHFLUSSZYTOMETRIE 32
2.11 AGAROSEGELE FUER DIE GELELEKTROPHORESE 33
2.12 ZELLEN, ZELLLINIEN UND TRANSFEKTANTEN 34
2.12.1 HUMANE PBMZ 34
2.12.2 ETABLIERTE ZELLLINIEN IM LABOR 34
2.12.3 SELBSTGENERIERTE ODER NEU ETABLIERTE ZELLEN 40
2.13 CHEMOKOMPETENTE BAKTERIENZELLEN 41
2.14 GERAETE 42
2.15 KUNSTSTOFF- UND GLASWARE 43
2.16 COMPUTERPROGRAMME 43
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
3 METHODEN 44
3.1 POLYMERASE KETTEN REAKTION 44
3.1.1 PCR FUER KLONIERUNGSEXPERIMENTE 44
3.1.2 PCR ZUR GEZIELTEN PUNKTMUTAGENESE VON TZR KETTEN 45
3.2 KLONIERUNG VON DNS 46
3.2.1 DNS-VERDAU MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 47
3.2.2 DEPHOSPHORYLIERUNG 47
3.2.3 LIGATION 48
3.2.4 AUFFUELLEN DER ENDEN ( ENDFILLINCF ) 48
3.2.5 DNS-AUFREINIGUNG 49
3.3 HERSTELLUNG VON PUNKTMUTIERTER TZR-DNS MITTELS GEZIELTER
MUTAGENESE.... 49
3.4 HERSTELLUNG VON CHEMOKOMPETENDEN ZELLEN 49
3.5 TRANSFORMATION 50
3.6 PLASMIDPRAEPARATION AUS BAKTERIEN 51
3.6.1 QIAPREP MINIPREP 51
3.6.2 ENDOFREE-MAXI-PRAEPARATION 51
3.7 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNS 52
3.8 SEQUENZIERUNG VON PLASMID-DNS 52
3.9 PBMZ-AUFREINIGUNG AUS BLUTPROBEN ( BUFFY COATAE 1 ) 53
3.10 GENERIERUNG VON CMV PP65 4 95-503-SPEZIFISCHEN HUMANEN T-ZELLEN 53
3.11 CD8 POSITIVE MAGNETISCHE ZELLSORTIERUNG 54
3.12 EXPANSION DER ISOLIERTEN CMV- PP65 4 95- 5 03-SPEZIFISCHEN HUMANEN
T-ZELLEN55
3.13 PEPTIDSPEZIFISCHE EXPANSION VON HUMANEN T-ZELLEN (T2-PROTOKOLL) 55
3.14 CD3/CD28 BEADS RESTIMULIERUNG VON HUMANEN PBMZ 56
3.15 RETROVIRALE TRANSDUKTION VON HUMANEN / MURINEN T-ZELLEN 56
3.15.1 RETROVIRALE TRANSDUKTION MIT EINEM TZR 57
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
3.15.2 SIMULTANE RETROVIRALE TRANSDUKTION MIT EINEM PP65 495 -503- UND
EINEM
P53 2 64-272-TUMORANTIGEN-SPEZIFISCHEN TZR 59
3.15.3 ANALYSE DES INTERAKTIONSVERHALTENS ZWISCHEN DEM P53 2
64-272SPEZIFISCHEN EINZELKETTEN-TZR UND HUMANEN UND MURINEN TZRA
KETTEN 60
3.16 ELEKTROPORATION VON HUMANEN T-ZELLEN 60
3.17 DURCHFLUSSZYTOMETRIE 61
3.17.1 FACS-ANALYSE AUF OBERFLAECHENMOLEKUELE... 62
3.17.2 TETRAMER-FAERBUNG 62
3.17.3 INTRAZELLULAERE ZYTOKINFAERBUNG 62
3.17.4 ANALYSE DES TZRSS-REPERTOIRES VON HUMANEN T ZELLEN 63
3.17.5 SCATCHARD-ANALYSEN 64
3.18 ZELLSORTIERUNG 64
3.19 HUMANER INTERFERON-Y ELISA/ MURINER IL-2 ELISA 65
3.20 51 CR-ZYTOTOXIZITAETSTEST 66
3.21 51 CR-KOMPETITIONSTEST 68
3.22 KRYOKONSERVIERUNG VON ZELLEN 69
3.23 AUFTAUEN VON ZELLEN 69
4 ERGEBNISSE 70
4.1 INTERAKTIONSVERHALTEN DER CMV-PP65 4 9 5 .503- SPEZIFISCHEN TZRA UND
-SS KETTE MIT TZRA UND -SS KETTEN FREMDER SPEZIFITAETEN 70
4.2 GENERIERUNG UND OPTIMIERUNGEN VON PP65 4 95- 5 03-SPEZIFISCHEN TZR
KONSTRUKTEN 81
4.2.1 GENERIERUNG VON NEUARTIGEN PP65 495 -503-SPEZIFISCHEN TZR 81
4.2.2 KODON-OPTIMIERUNG DES PP65 495 -503 -SPEZIFISCHEN TZR 91
4.2.3 ANALYSE EINES PP65 4 9 5 -503 -SPEZIFISCHEN EINZELKETTEN- UND
DOPPELKETTEN-TZR 94
4.3 GENERIERUNG VON BI-SPEZIFISCHEN HUMANEN T-ZELLEN 98
IMAGE 5
INHALTSVERZEICHNIS
4.3.1 GENERIERUNG VON TYROSINASE 36 8-376 -TUMORANTIGEN- SOWIE
PP65495.503
ODER MDM2AI-88- BI-SPEZIFISCHEN HUMANEN T-ZELLEN 99
4.3.2 GENERIERUNG VON P53 2 64-272-TUMORANTIGEN UND PP65 4 G5- 5
03-BISPEZIFISCHEN T-ZELLEN MITTELS DEM RNS-TRANSFER SOWIE RETROVIRALEM
GENTRANSFER 102
4.3.2.1 GENERIERUNG VON PP65 4 95-503-SPEZIFISCHEN-T-ZELLEN AUS
HCMVSEROPOSITIVEN DONOREN 102
4.3.2.2 ANALYSE DER SUBFAMILIEN DES TZR REPERTOIRES DER PP65 4 95- 5
03PEPTIDSPEZIFISCHEN T-ZELLKULTUR 111
4.3.2.3 UMPROGRAMMIERUNG DER PP65 4 G 5 -503-SPEZIFISCHEN T-ZELLEN ZU
P53 2 64-272-TUMORANTIGEN- UND PP65 4 GS-SO3-BI-SPEZIFISCHEN
TEFFEKTORZELLEN MITTELS DEM RNS-TRANSFER 113
4.3.2.4 RETROVIRALE TRANSDUKTION DER PP65 49 5-503-SPEZIFISCHEN T-ZELLEN
MIT EINEM P53 2 64-272-TUMORANTIGEN-SPEZIFISCHEN TZR 116
4.3.2.5 RETROVIRALE TRANSDUKTION DES PP65 4 G5-5 0 3 -SPEZIFISCHEN T21
-TZELLKLONS MIT EINEM P53 264 - 2 72 -TUMORANTIGEN-SPEZIFISCHEN TZR
121
4.3.2.6 SIMULTANE RETROVIRALE TRANSDUKTION EINES PP65 4 G5. 50 3- UND
P53 264 -272-TUMORANTIGEN-SPEZIFISCHEN TZR IN HCMV-NEGATIVE
T-ZELLEN 123
4.3.2.7 ANALYSE DER EXPRESSION VON ENDOGENEN TZR DER SIMULTAN
TRANSDUZIERTEN HUMANEN T-ZELLEN 127
4.3.3 ANALYSE DER KOMPETITION ZWISCHEN DEM P53 264 . 2 7 2
-TUMORANTIGEN- UND DEM PP65 4 G 5 .SO3-SPEZIFISCHEN PEPTID 129
4.4 INTERAKTIONSVERHALTEN EINES P53 264 - 2 7 2
-TUMORANTIGEN-SPEZIFISCHEN
EINZELKETTEN-TZR 131
4.4.1 ANALYSE DES INTERAKTIONSVERHALTENS EINES P53 264 . 2 7 2
-TUMORANTIGENSPEZIFISCHEN EINZELKETTEN-TZR UNTER VERWENDUNG EINES
2-PLASMIDERETROVIRALEN VEKTORSYSTEMS 132
IMAGE 6
INHALTSVERZEICHNIS
4.4.2 GEZIELTE PUNKTMUTAGENESE IN DER VA-DOMAENE ZUR DETAILLIERTEN
ANALYSE DER INTERAKTION DES P53 26 4 - 2 72 -TUMORANTIGEN-SPEZIFISCHEN
EINZELKETTEN-TZR 138
4.4.3 ANALYSE DES INTERAKTIONSVERHALTENS EINES P53 26 4 - 2 7 2
-TUMORANTIGEN SPEZIFISCHEN EINZELKETTEN-TZR UNTER VERWENDUNG EINES 1
-PLASMIDRETROVIRALEN VEKTORSYSTEMS 143
4.4.4 GEZIELTE PUNKTMUTAGENESE DES P53 26 4 -272 -TUMORANTIGEN
SPEZIFISCHEN EINZELKETTEN-TZR EINES 1 -PLASMID-RETROVIRALEN
VEKTORSYSTEMS 153
4.4.5 OPTIMIERUNGSVERFAHREN DES P53 2 64-272-TUMORANTIGEN-SPEZIFISCHEN
EINZELKETTEN-TZR ZUR INHIBITION DER INTERAKTION MIT FREMDEN TZRA
KETTEN 159
4.4.6 ANALYSE DER TZR-MHC:PEPTID-AFFINITAET DES MODIFIZIERTEN,
OPTIMIERTEN
P53 26 4-272 -TUMORANTIGEN-SPEZIFISCHEN EINZELKETTEN-TZR 166
4.4.7 EFFIZIENTE TUMORERKENNUNG DER HUMANEN
P53264-272-TUMORANTIGENSPEZIFISCHEN T-ZELLEN IN VITRO 169
I DISKUSSION 171
5.1 OPTIMIERUNGEN DER TZR-KONSTRUKTE 171
5.1.1 HYBRIDE TZR UND DAS RISIKO EINER OFF -ZIELUNGERICHTETEN
AUTOREAKTIVITAET 171
5.1.2 ESSENTIELLE FAKTOREN DER TZR-AVIDITAET 175
5.2 GENERIERUNG VON BI-SPEZIFISCHEN T-ZELLEN 180
5.2.1 HCMV-SEROPOSITIVER STATUS VON DONOR UND REZIPIENT 180
5.2.2 UNTERSCHIEDLICHER HCMV-STATUS ZWISCHEN DONOR UND REZIPIENT. 186
5.3 SICHERHEITSASPEKT EINES P53 2 64- 2 7 2 - TUMORANTIGEN-SPEZIFISCHEN
EINZELKETTEN- TZR 189
5.3.1 0/7- -ZIELGERICHTETE REAKTIONEN SOWIE IMMUNOGENITAET EINES
PARTIELL
MURINISIERTEN ODER VOLLLAENGEN-MURINEN-TZR 189
5.3.2 INTERAKTIONSVERHALTEN EINES P53 26 4 -272
-TUMORANTIGEN-SPEZIFISCHEN
EINZELKETTEN-TZR 191
IMAGE 7
INHALTSVERZEICHNIS
5.3.3 AUSBLICK 199
6 ZUSAMMENFASSUNG 203
7 LITERATURVERZEICHNIS 206
8 ANHANG 219
9 DANKSAGUNG 223
10 LEBENSLAUF 224
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