Die funktionelle Charakterisierung des Augenfleckproteins SOUL3 in Chlamydomonas ReinhardtII:
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2013
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|---|---|
| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS I
1. ZUSAMMENFASSUNG/SUMM
ARY 1
2. EINLEITUNG 3
2.1 DIE
C.
REINHARDTII-
Z
ELLZ 3
2.1.1 C. REINHARDTII ALS
EUK.ARYOTISCHER MODELLORGANISMUS ; 5
2.2 DER AUGENFLECK UND
DIE PHOTOTAXIS VON
C. R
EINHARDTII 6
2.2.1 POSITION DES
AUGENFLECKS IN DER ZELLE 6
2.2.2 ULTRASTRUKTUR UND FUNKTIONSWEISE DES AUGENFLECKS 7
2.2.3 PHOTOMOTILITAET VON C. REINHARDTII 9
2.2.4 BEKANNTE KOMPONENTEN DES AUGENFLECKS 10
2.2.5 DAS AUGENFLECKPROTEOM
UND -PHOSPHOPROTEOM VON
C. REINHARDTII 11
2.2.6 DIE SOUL/HBP FAMILIE 13
2.2.7 TETRAPYRROLE ALS KOFAKTOREN
IN PFLANZLICHEN ZELLEN 14
2.3 BIOLOGISCHE RHYTHMEN UND DIE CIRCADIANE UHR 17
2.3.1 DAS CIRCADIANE SYSTEM IN
C. REINHARDTII 18
2.4 AUFGABENSTELLUNG 20
3. ERGEBNISSE 21
3.1 UNTERSUCHUNGEN DER SOUL/HBP-DOMAENE DES AUGENFLECK-PROTEINS SOUL3 21
3.1.1 VERGLEICH DER AMINOSAEURESEQUENZEN
VERSCHIEDENER SOUL/HBPS AUS
UNTERSCHIEDLICHEN SPEZIES 21
3.1.2 HERSTELLUNG EINES VEKTORS ZUR UEBEREXPRESSION VON
SOUL3 22
3.1.3 UEBEREXPRESSION UND AUFREINIGUNG
VON SOUL3 IN E. COLI 23
3.1.4 KOFAKTOR BLNDUNGSVERSUCHE MIT HAEMIN-AGAROSE 24
3.1.5 SPEZIFITAET DER HAEMINBINDUNG AN SOUL3 25
3.1.6 DAS ABSORPTIONSSPEKTRUM VON SOUL3 27
3.2 IDENTIFIZIERUNG POTENTIELLER INTERAKTIONSPARTNER
VON SOUL3 29
3 . 2.1 KOMPLEXBILDUNGSVERHALTEN VON SOUL3 29
3.2.2 IDENTIFIZIERUNG POTENTIELLER INTERAKTIONSPARTNER VON
SOUL3 30
3.3 LOKALISIERUNGSSTUDIEN VON SOUL3 IN C. REINHARDTII 33
3.3.1 MEMBRANAUFREINIGUNG/*NA
2
C03-STRIPPING 33
3.3.2 SUBZELLULAERE LOKALISIERUNG VON SOUL3 MITTELS INDIREKTER
IMMUNFLUORESZENZ
34
3.3.2.1 LOKALISIERUNG VON SOUL3 IN DER MUTANTE EVE3-2 SOWIE CHRL 36
3.4 SOUL3 KNOCK DOWN DURCH
ERZEUGUNG VON SOUL3 AMLRNS LINIEN 39
3.4.1 HERSTELLUNG EINES AMI
SO
UL3 KNS VEKTORS 39
3.4.2 CHARAKTERISIERUNG DER AMI
SO
UL3 ZELLLINIEN 41
3.4.2.1 LICHTMIKROSKOPISCHE CHARAKTERISIERUNG DER
AMISOUU
-ZELLLINIEN 43
3.4.2.2 ERMITTLUNG DER AUGENFLECKFLAECHE 46
3.4.2.3 ANALYSE DER PHOTOTAXISFAEHIGKEIT DER AMI
S
OUO-ZELLLINIEN 47
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INHALTSVERZEICHNIS II
4. DISKUSSION 49
4.1 SOUL3 BINDET HAEMIN 49
4.2 SOUL3 BILDET PROTEIN
KOMPLEXE MIT UNTERSCHIEDLICHEM MOLEKULARGEWICHT
....51
4.3 DIE IDENTIFIZIERUNG POTENTIELLER INTERAKTIONSPARTNER VON SOUL3 53
4.4 SOUL3 IST SPEZIFISCH IM AUGENFLECK LOKALISIERT 56
4.5 SOUL3 IST ALS PERIPHER ASSOZIIERTES
MEMBRAN
PROTEIN AN DEN
LIPID-GLOBULI
DES AUGENFLECKS LOKALISIERT 57
4.6 VERSUCHE ZUR FUNKTIONELLEN CHARAKTERISIERUNG DES SOUL3 PROTEINS IN
C. REINHARD
TII 59
4.6.1 DIE AMI
SO
UL3 ZELLLINIEN WEISEN
EIN REDUZIERTES SOUL3 PROTEINNIVEAU AUF 60
4.6.2 EINE REDUZIERUNG DES SOUL3 PROTEINNIVEAUS WIRKT SICH AUF
DIE KORREKTE
POSITIONIERUNG DES AUGENFLECKS AUS 62
4.6.3 AUCH DIE GROBE DER AUGENFLECKFLAECI-IE IST IN
DEN AMI
SO
UL3-
ZELLLINIEN VERAENDERT
64
4.6.4 DIE AMI
S0U
L3 ZELLLINIEN ZEIGTEN EIN GESTOERTES PHOTOTAKTISCHES VERHALTEN 66
5. MATERIAL UND METHODEN 68
5.1 MATERIAL 68
5.1.1 GERAETE A 68
I
5.1.2 CHEMIKALIEN 69
5.1.3 KITS UND VERBRAUCHSMATERIALIEN 69
5.1.4 ENZYME 70
5.1.5 ORGANISMEN 70
5.1.5.1 ESCHERICHIA COLI 70
5.1.5.2 CHLAMYAEOMONAS REINHARDTII 71
5.1.6 KOMMERZIELLE VEKTOREN 71
5.1.7 RECOMBINANTE PLASMIDE 71
5.1.7.1 PDI8 71
5.1.7.2 AV638730 72
5.1.7.3 PMS539 73
5.1.8 OLIGONUKLEOTIDE 74
5.1.9 MOLEKULARGEWICHTSTANDARDS 75
5.1.10 ANTISEREN 76
5.1.10.1 PRIMAERE ANTISEREN GEGEN DIE C-TERMINALE SOUL-DOMAENE 76
5.1.10.2 PRIMAERE ANTISEREN GEGEN KANALRHODOPSIN-1 (ENGL.
CHANNELRHODOPSIN: CHRL) 76
5.1.10.3 KOMMERZIELLE PRIMAERE ANTISEREN 76
5.1.10.4 SEKUNDAERE ANTISEREN 77
5.2 METHODEN 77
5.2.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 77
5.2.1.1 KULTIVIERUNG VON E. COLI-ZELLEN ZUR KLONIERUNG VON
GENKONSTRUKTEN 77
5.2.1.2 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNS AUS E. COLI 78
INHALTSVERZEICHNIS III
5.2.1.3 DNS-GELEKTROPHORESE 79
5.2.1.4 DIE AUFREINIGUNG VON DNS FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 79
5.2.1.5 DIE POLYMERASE KETTENREAKTION (ENGL. POLYMERASE CHAIN REACTION -
PCR) 79
5.2.1.6 ANNEALING EINZELSTRAENGIGER DNS-OLIGONUKLEOTIDE 80
5.2.1.7 PHOSPHORYLIERUNG VON FREIEN 5 -HYDROXYLGRUPPEN IN DNS-FRAGMENTEN
81
5.2.1.8 ENZYMATISCHER RESTRIKTIONSVERDAU VON DN S 82
5.2.1.9 LIGATION VON DNS-FRAGMENTEN 82
5.2.1.10 TRANSFORMATION VON E. COLI 83
5.2.1.11 HERSTELLUNG KOMPETENTER E. COLI-ZELLEN 83
5.2.1.12 PHOTOMETRISCHE QUANTIFIZIERUNG VON NUKLEINSAEUREN 84
5.2.1.13 QUANTIFIZIERUNG VON NUKLEINSAEUREN DURCH DEN *DOT TEST 84
5.2.2 KULTIVIERUNG VON C. AEX *.RIOT/-KULTUREN (HARRIS 1989) 85
5.2.2.1 ANZUCHT VON C. REINHARDTII 85
5.2.2.2 ERNTE VON C. /-E//?ARAW/-KULTUREN (NACH ZHAO ET AL., 2004) 86
5.2.2.3 ZELLZAHLBESTIMMUNG VON C. REINHARDTII 86
5.2.2.4 GEWINNUNG VON AUTOLYSIN (MODIFIZIERT NACH HARNS, 1989) 86
5.2.2.5 TRANSFORMATION VON C, REINHARDTII MIT GLASPERLEN (KINDLE, 1990;
DAVIES ET AL., 1992; KIAULEHN
DIPLOMARBEIT, 2006) 87
5.2.2.6 VORBEREITUNG DER GLASPERLEN FUER DIE TRANSFORMATION VON C.
REINHARDTII 88
5.2.2.7 AUFBEWAHRUNG VON C. REINHARDTII-KULTUREN IN FLUESSIGEM STICKSTOFF
(CMTCHFIELD ET AL., 1999) ...89
5.2.3 BIOCHEMISCHE METHODEN 89
5.2.3.1 HERSTELLUNG EINES PROTEIN-ROHEXTRAKTES AUS C. REINHARDTII (ZHAO
ET AL., 2004) 89
5.2.3.2 HERSTELLUNG EINES GESAMTPROTEINEXTRAKTES (MODIFIZIERT NACH
KLEINER ET AL. 1999) 90
5.2.3.3 SACCHAROSE DICHTEGRADIENT (ZHAO ET AL., 2004) 90
5.2.3.4 ANREICHERUNG VON MEMBRANASSOZIIERTEN PROTEINEN MITTELS
*NA^CO;,-STRIPPING (NACH FUJIKI ET
AL. 1982) 91
5.2.3.5 AUGENFLECKAUFREINIGUNG 92
5.2.3.6 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION NACH DER *NEUHOFF-METHODE
(NEUHOFF ET AL., 1979) 92
5.2.3.7 DENATURIERENDE POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) ZUR
AUFTRENNUNG VON
PROTEINGEMISCHEN (NACH LAEMMLI, 1970) 93
5.2.3.8 FAERBUNG DER PROTEINE NACH POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
MITTELS COOMASSIE (MODIFIZIERT
NACH MERRIL, 1990) 93
5.2.3.9 WESTEM-TRANSFER 94
5.2.3.10 PONCEAU-FAERBUNG NACH WESTERN-TRANSFER 94
5.2.3.11 IMMUNODETEKTION VON PROTEINEN (SCHULZE DIPLOMARBEIT, 2008) 95
5.2.3.12 NACHWEIS DER ANTIKOERPER-BINDUNG MIT MEERRETTICH-PEROXIDASE 95
5.2.3.13 KOIMMUNOPRAEZIPITATION 96
5.2.3.14 IN AE/YW-DETEKTION VON PROTEINEN MITTELS INDIREKTER
IMMUNOFLUORESZENZ IN C. REINHARDTII
(MODIFIZIERT NACH MITTELMEIER ET AL., 2008 UND GEORG KREIMER,
PERSOENLICHE KOMMUNIKATION) ...98
INHALTSVERZEICHNIS
IV
5.2.3.15 DOPPEL-IMMUNFLUORESZENZMARKIERUNG VON PROTEINEN MIT
SPEZIESGLEICHEN ANTIKOERPERN (NACH
INO 2004) 99
5.2.3.16 UEBEREXPRESSION UND NATIVE AUFREINIGUNG VON HISTIDIN-MARKIERTEN
PROTEINEN IN E. COLI 99
5.2.3.17 ENTFERNUNG DER HISTIDIN-MARKIERUNG BEI NATIV AUFGEREINIGTEN
PROTEINEN 101
5.2.3.18 KOFAKTOR-BINDUNGVERSUCH MIT HAEMIN-AGAROSE 101
5.2.3.19 MESSUNG DER SPEKTROSKOPISCHEN EIGENSCHAFTEN VON SOUL3 IM
LICHTSPEKTRUM 103
5.2.3.20 MANUELLE MESSUNG DER PHOTOAXIS BEI C. REINHARDTII 103
5.2.3.21 HELLFELDMIKROSKOPIE UND MESSUNG DER AUGENFLECKGROESSE BEI C.
REINHARDTII 104
5.2.4 MASSENSPEKTROMETRISCHE (MS) PROTEINANALYSE 104
5.2.4.1 MS-KOMBATIBLE SDS-PAGE 104
5.2.4.2 TRYPTISCHER IN-GEL-VERDAU 105
5.2.4.3 IDENTIFIZIERUNG VON PROTEINEN MITTELS MASSENSPEKTROMETRIE 106
6. LITERATURVERZEICHNIS 107
7. ANHANG 118
7.1 SEQUENZEN UND VEKTOREN 118
7.1.1 SOUL/HBP SEQUENZANALYSEN 118
7.1.2 LISTE DER IDENTIFIKATIONSNUMMERN (NCBI) UND AMINOSAEURE-SEQUENZEN
119
7.1.3 VEKTORKARTEN UND SEQUENZEN 122
7.1.3.1 PTS27 122
7.1.3.2 PTS29 123
CURRICULUM VITAE 124
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 127
ABBILDUNGS
VERZEICHNIS 129
TABELLENVERZEICHNIS 131
DANKSAGUNG 132
SELBSTAENDIGKEITSERKLAERUNG 133
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