Gezielte Genmodifikation in Mauszygoten durch sequenzspezifische Nukleasen:
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2013
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ABSTRACT 1
ZUSAMMENFASSUNG 3
1 EINLEITUNG 5
1.1 VERSCHIEDENE ARTEN DER GENOM-MANIPULATION 5
1.1.1 DER P/II C5/-INTEGRASE VERMITTELTE KASSETTENAUSTAUSCH 7
1.1.2 GEN-TARGETING MIT HILFE VERSCHIEDENER SEQUENZSPEZIFISCHER
NUKLEASEN . 8
1.1.2.1 ZINKFINGER-NUKLEASEN 12
1.1.2.2 TRANSCRIPTION ACTIVATOR-LIKE EFFECTOR NUCLEASES 16
1.2 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT 19
2 ERGEBNISSE 21
2.1 GEZIELTE GENOM-MODIFIKATION DURCH DIE P/ C37-INTEGRASE VERMITTELTE
REKOMBI
NATION 21
2.2 GENOM-MODIFIKATIONEN MITTELS ZFN 24
2.2.1 GENETISCHE MANIPULATION DES ROSA26-LOCUS 24
2.2.1.1 INTEGRATION DES /3-GA/-REPORTERGENS 24
2.2.1.2 INTEGRATION DES VFEM/S-REPORTERGENS 36
2.2.2 ZFN-UNTERSTUETZTE EINBRINGUNG VON PUNKTMUTATIONEN IN DAS RAB38-GEN
49
2.2.2.1 INTEGRATION DER IDGCHT-PUNKTMUTATION DURCH INJEKTIONEN IN
ZYGOTEN 49
2.2.2.2 INTEGRATION DER IDGWT-PUNKTMUTATION DURCH DIE HR IN DAS
GENOM VON ZYGOTEN 56
2.3 TALEN-VERMITTELTE GENOM-MANIPULATION 68
2.3.1 MODIFIKATION DES /TOWS-LOCUS DURCH DIE VORKERN-INJEKTION VON TALEN
68
2.3.1.1 INTEGRATION DER IDGCHT-PUNKTMUTATION IN DAS GENOM VON
RAB38
M
-TYGOT&N 70
2.3.1.2 INTEGRATION DER IDGWT-PUENKTMUTATION IN DEN RAB38-LOCUS
DURCH DIE VERWENDUNG VON TALEN IN ZYGOTEN 78
3 DISKUSSION 85
3.1 INTEGRATION EXOGENER DNA-SEQUENZEN DURCH DIE PHIC31
INTEGRASE-VERMITTELTE
REKOMBINATION 85
3.2 ZFN-VERMITTELTE GENOM-MODIFIKATION 86
3.3 TALEN-VERMITTELTE MANIPULATION DES GENOMS 89
3.4 VERGLEICH DER ZFN MIT DEN TALEN 90
3.5 SCHLUSSFOLGERUNG UND AUSBLICK 92
4 MATERIAL 93
4.1 VERWENDETE GERAETE 93
4.2 VERBRAUCHSMATERIALIEN 94
4.3 CHEMIKALIEN 95
4.4 KITS 99
III
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INHALTSVERZEICHNIS
4.5 OLIGONUKLEOTIDE 99
4.5.1 OLIGONUKLEOTIDE FUER GENOTYPISIERUNGS-PCRS 99
4.5.2 PCR ZUR HERSTELLUNG VON SOUTHERN BLOT-SONDEN 100
4.6 LOESUNGEN 100
4.7 MAUSLINIEN 104
5 METHODEN 105
5.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 105
5.1.1 HERSTELLUNG ELEKTROKOMPETENTER BAKTERIEN 105
5.1.2 TRANSFORMATION VON ELEKTROKOMPETENTEN BAKTERIEN 105
5.1.3 BLAU-WEISS-SELEKTION 106
5.1.4 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA 106
5.1.5 VERDAU VON PLASMID-DNA MIT RESTRIKTIONSENZYMEN 106
5.1.6 GELELEKTROPHORESE UND GELEXTRAKTION VON DNA-FRAGMENTEN 107
5.1.7 PRAEZIPITATION VON DNA 107
5.1.8 BESTIMMUNG DER MASSENKONZENTRATION VON NUKLEINSAEUREN 108
5.1.8.1 BESTIMMUNG DER MASSENKONZENTRATION IN PHOTOMETER .... 108
5.1.8.2 BESTIMMUNG DER DNA-MASSENKONZENTRATION MIT HILFE EINES
AGAROSE-GELS 108
5.1.9 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN 108
5.1.10 ISOLIERUNG GENOMISCHER DNA 109
5.1.10.1 DNA-ISOLIERUNG AUS EMBRYONEN 109
5.1.10.2 ISOLIERUNG GENOMISCHER DNA AUS MAUSSCHWAENZEN 109
5.1.11 POLYMERASE-KETTEN-REAKTION 109
5.1.12 AUFREINIGUNG VON PCR-PRODUKTEN 110
5.1.13 SEQUENZIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN 110
5.1.14 SOUTHERN BLOT ANALYSE 110
5.1.14.1 RESTRIKTIONSVERDAU UND BLOTTEN DER GENOMISCHEN DNA . ... 111
5.1.14.2 HERSTELLUNG RADIOAKTIV MARKIERTER DNA-SONDEN 112
5.1.14.3 HYBRIDISIERUNG 112
5.1.14.4 AUTORADIOGRAPHIE 112
5.1.15 IN VITRO TRANSKRIPTION DER RNA 112
5.1.16 HERSTELLUNG DER INJEKTIONSLOESUNGEN FUER DIE VOERKERN-INJEKTION 113
5.2 HISTOLOGIE 114
5.2.1 LACZ-FAERBUNG VON EMBRYONEN 114
5.2.2 ANALYSE DER SS-GA/-EXPRESSION IN ES-ZELLEN 114
5.2.3 LACZ-FAERBUNG VON ZYGOTEN ZUR /3-GA/-EXPRESSIONANALYSE 114
5.3 ZELLKULTUR 115
5.3.1 ARBEITEN MIT ES-ZELLEN 115
5.3.1.1 SPLITTEN VON ES-ZELLEN 115
5.3.1.2 EINFRIEREN VON ES-ZELLEN 115
5.3.1.3 AUFTAUEN VON ES-ZELLEN 116
5.3.1.4 ELEKTROPORATION VON ES-ZELLEN 116
5.3.2 ARBEITEN MIT HEK293-ZELLEN 116
5.3.2.1 KULTIVIERUNG DER ZELLEN 117
5.3.2.2 TRANSIENTE TRANSFEKTION VON HEK293-ZELLEN 117
IV
INHALTSVERZEICHNIS
5.3.2.3 LYSIEREN VON ZELLEN 117
5.3.2.4 SS-GAL AKTIVITAETSMESSUNG AM LUMINOMETER 118
5.4 DIE ARBEIT MIT MAEUSEN 119
5.4.1 MAUSHALTUNG 119
5.4.2 VORKERN-INJEKTION IN ZYGOTEN 119
5.4.3 EMBRYONENTRANSFER 120
6 ANHANG 137
6.1 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 137
6.2 SYMBOLE FUER AMINOSAEUREN 143
6.3 VEKTOREN UND OLIGONUKLEOTIDE 144
6.3.1 VEKTOREN FUER DIE HOMOLOGE REKOMBINATION 144
6.3.1.1 PBVENUSB 144
6.3.1.2
P
ROSA26.5 144
6.3.1.3 PROSA 26.8-2 144
6.3.1.4 PROSA 26.3-3 144
6.3.1.5 PEF-5HA-CHT-3HA 145
6.3.1.6 PEF-5HA-WT-3HA 145
6.3.1.7 PEF-5HA-TALCHT-3HA 145
6.3.1.8 PEF-5HA-TALWT-3HA 145
6.3.2 OLIGONUKLEOTIDE FUER DIE HOMOLOGE REKOMBINATION 146
6.3.2.1 ZFNCHT IDGWT 146
6.3.2.2 TALENWT IDGCHT 146
6.3.3 EXPRESSIONSVEKTOREN FUER ZFN UND TALEN 146
6.3.3.1 PPHIC31 146
6.3.3.2 PROSAZFN-FOKEL 147
6.3.3.3 PROSAZFN-FOKKK 147
6.3.3.4 PRABZFN-FOKKK 147
6.3.3.5 PRABZFN-FOKEL 147
6.3.3.6 PRABTALEN
1 -FOKWT 148
6.3.3.7 PRABTALEN
2-FOKWT 148
6.3.4 SONSTIGE VEKTOREN 148
6.3.4.1 PCR-II-ROSA5 -SONDE 148
6.3.4.2 PCR-II-ROSA3 -SONDE 148
6.3.4.3 PUC18 149
6.3.4.4 PSC-B-AMP/KAN 150
6.4 ES-ZELLKULTUR TESTEXPERIMENT MIT DEN ROSA26 ZFN 151
6.5 EXPRESSIONSANALYSE DES VENUS-REPORTERGENS IN VERSCHIEDENEN ORGANEN
152
6.6 FELLFARBEN DER RAB38
Z
,DGCH
NACHKOMMEN 154
6.7 EIGENE PUBLIKATIONEN 155
6.8 GENEHMIGUNGEN ZUR VEROEFFENTLICHUNG 160
6.8.1 PNAS 160
6.8.2 BIOSPEKTRUM 161
V
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