Untersuchung der Abhängigkeit der Mitophagie von der mitochondrialen Teilungskomponente DRP1 unter zellulären Stressbedingungen:
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2012
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I N H A L T
1. EINLEITUNG 1
1.1 M I T O C H O N D R I E N 1
1.1.1 AUFBAU U N D FUNKTION 1
1.1.2 URSPRUNG U N D BIOGENESE 2
1.2 MITOCHONDRIALE DYNAMIK 3
1.2.1 FUSION V O N M I T O C H O N D R I E N 3
1.2.2 TEILUNG V O N M I T O C H O N D R I E N 5
1.3 MITOCHONDRIALE G E N E T I K 7
1.4 MITOCHONDRIALE ERKRANKUNGEN 9
1.4.1 KLASSISCHE M I T O C H O N D R I O P A T H I E N 9
1.4.2 ERKRANKUNGEN D U R C H S T OE R U N G E N D E R M I T O C H O N D R
I A L E N DYNAMIK 1 0
1.4.3 ROLLE M I T O C H O N D R I A L E R DYSFUNKTIONEN IN D E G E N E R
A T I V E N ERKRANKUNGEN D E S ALTERS. 1 0
1.5 A U T O P H A G I E 1 1
1.5.1 EINTEILUNG D E R A U T O P H A G I E 1 1
1.5.2 M E C H A N I S M E N D E R M A K R O A U T O P H A G I E 1 2
1.5.3 ABBAU V O N M I T O C H O N D R I E N 1 4
1.6 ZIELSETZUNG D E R ARBEIT 1 5
2. MATERIAL U N D M E T H O D E N 1 7
2.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE M E T H O D E N 1 7
2.1.1 ERZEUGUNG E L E K T R O P O R A T I O N S K O M P E T E N T E R F.
COLI ZELLEN 1 7
2.1.2 T R A N S F O R M A T I O N V O N E. COLI M I T PLASMID-DNA 1 7
2.1.3 ISOLIERUNG V O N PLASMID-DNA A U S E. COLI 1 8
2 . 1 . 4 K O N Z E N T R A T I O N S B E S T I M M U N G V O N DNA 1 8
2.1.5 TRANSIENTE TRANSFEKTION V O N SAEUGETIERZELLEN M I T PLASMID-DNA 1
8
2.1.6 LENTIVIRALE TRANSDUKTION 1 8
2.1.7 V E R W E N D E T E PLASMIDE 1 9
2.2 ZELLBIOLOGISCHE M E T H O D E N 1 9
2.2.1 V E R W E N D E T E ZELLLINIEN 1 9
2.2.2 KULTIVIERUNG V O N SAEUGETIERZELLEN 1 9
2.2.3 EINFRIEREN U N D LAGERN D E R ZELLEN 2 0
2.2.4 A U F T A U E N V O N ZELLEN 2 0
2.2.5 B E S T I M M U N G D E R ZELLZAHL 2 0
2.2.6 INDUKTION V O N OXIDATIVEM STRESS U N D NAEHRSTOFFKARENZ 2 0
2.2.7 FIXIERUNG U N D PERMEABILISIERUNG V O N ZELLEN 2 1
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IMAGE 2
2 . 2 . 8 KONFOKALE MIKROSKOPIE 2 1
2.2.9 QUANTIFIZIERUNG D E R MITOPHAGIE 2 2
2.2.10 QUANTIFIZIERUNG D E R MITOCHONDRIALEN M O R P H O L O G I E 2 2
2.2.11 B E S T I M M U N G D E R PROTEOLYTISCHEN AKTIVITAET 2 2
2.2.12 ELEKTRONENMIKROSKOPIE 2 3
2.3 PROTEINBIOCHEMISCHE M E T H O D E N 2 4
2.3.1 SDS-PAGE 2 4
2.3.2 TRANSFER V O N P R O T E I N E N A U F N I T R O C E L L U L O S E
M E M B R A N E N ( W E S T E R N B L O T ) 2 4
2.4 IMMUNOLOGISCHE M E T H O D E N 2 5
2.4.1 IMMUNOLOGISCHE FAERBUNG V O N ZELLEN 2 5
2.4.2 I M M U N D E T E K T I O N V O N P R O T E I N E N 2 5
2.5 PUFFER U N D M E D I E N 2 6
2.6 CHEMIKALIEN U N D VERBRAUCHSMATERIAL 2 7
2.7 G E R AE T E 2 9
3. ERGEBNISSE 3 2
3.1 OXIDATIVER STRESS INDUZIERT MITOPHAGIE 3 2
3.1.1 QUANTIFIZIERUNG D E R MITOPHAGIE 3 2
3.1.2 OXIDATIVER STRESS F UE H R T Z U R F R A G M E N T I E R U N G V O
N M I T O C H O N D R I E N U N D Z U R INDUKTION
V O N MITOPHAGIE 3 5
3.2 DIE KOLOKALISATION V O N GFP-LC3 U N D M I T O C H O N D R I E N IST
A B H AE N G I G V O N ATG5 3 8
3.3 OXIDATIVER STRESS INDUZIERT SELEKTIV MITOPHAGIE 4 1
3.4 DIE INDUKTION D E R MITOPHAGIE IST ABHAENGIG V O N DRP1 4 4
3.4.1 DIE EXPRESSION V O N D O M I N A N T N E G A T I V E M DRP1 V E R
H I N D E R T D I E F R A G M E N T I E R U N G V O N
M I T O C H O N D R I E N U N T E R MILDEM OXIDATIVEM STRESS 4 4
3.4.2 DIE INDUKTION V O N MITOPHAGIE IST ABHAENGIG V O N DRP1 4 5
3.4.3 D O M I N A N T NEGATIVES DRP1 H A T K E I N E N INHIBITORISCHEN
EFFEKT A U F D I E A L L G E M E I N E
AUTOPHAGIE 4 9
4. DISKUSSION 5 2
4 . 1 INDUKTION D E R M I T O P H A G I E 5 3
4.1.1 QUANTIFIZIERUNG D E R MITOPHAGIE 5 3
4.1.2 NAEHRSTOFFLIMITATION INDUZIERT MITOPHAGIE 5 5
4.1.3 OXIDATIVER STRESS INDUZIERT SELEKTIV MITOPHAGIE 5 5
4.2 DIE ROLLE D E R M I T O C H O N D R I A L E N FISSION IN D E R
MITOPHAGIE 5 7
4 . 3 B E D E U T U N G D E R M I T O P H A G I E IN D E R
QUALITAETSSICHERUNG V O N M I T O C H O N D R I E N 5 9 -
5. Z U S A M M E N F A S S U N G 6 1
6. LITERATURVERZEICHNIS 6 3
IMAGE 3
ABKUERZUNGEN
DANKSAGUNGEN
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