Zur Lokalisation von K+-Kanaluntereinheiten in Lipid rafts und dem Einfluss des Cholesterolgehaltes der Zellmembran auf K+-Ströme in linksventrikulären Kardiomyozyten der Ratte:
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2012
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INHALTSVERZEICHNIS
ZUSAMMENFASSUNG 1
ABSTRACT 3
1 EINLEITUNG 5
1.1 DER ERREGUNGSZYKLUS DES HERZENS 5
1.2 DAS VENTRIKULAERE AKTIONSPOTENZIAL UND DIE ZUGRUNDE
LIEGENDEN IONENKANAELE 7
1.2.1 DIE IONENTHEORIE DER ERREGUNG 7
1.2.2 IONENKANAELE UND GANZZELLSTROEME 9
1.2.3 DAS VENTRIKULAERE AKTIONSPOTENZIAL 11
1.2.4 AM AKTIONSPOTENZIAL BETEILIGTE IONENSTROEME UND
ZUGRUNDE LIEGENDE KANAELE 12
1.3 DER TRANSIENTE K + AUSWAERTSSTROM I T0 16
1.4 PHARMAKOLOGISCHE EIGENSCHAFTEN DER K + STROEME DES RATTENHERZENS 17
1.5 DIE PLASMAMEMBRAN DER ZELLE 18
1.5.1 DAS FLUID MOSAIC MODELL DER PLASMAMEMBRAN 19
1.5.2 CHOLESTERINREICHE MIKRODOMAENEN DER PLASMAMEMBRAN: LIPID RAFLS 19
1.5.2.1 LOKALISATION KARDIALER IONENKANAELE IN LIPID RAFLS 21
1.5.2.2 PHARMAKOLOGISCHE MODULATION DER MEMBRANIIPIDE: MSSCD 23
2 MATERIAL UND METHODEN 25
2.1 MATERIAL 25
2.1.1 ZELLENTNAHME UND ZELLPRAEPARATION 25
2.1.2 VERSUCHSLOESUNGEN FUER DIE ELEKTROPHYSIOLOGISCHEN EXPERIMENTE 25
2.1.3 HERSTELLUNG DER METHYL-SS-CYCLODEXTRIN- BZW.
CHOLESTEROL-GESAETTIGTEN
METHYL-SS-CYCLODEXTRIN-LOESUNG 26
2.2 ELEKTROPHYSIOLOGISCHE METHODEN 27
2.2.1 REGIONALSPEZIFISCHE ISOLATION VON RATTENKARDIOMYOZYTEN 27
2.2.2 BESCHREIBUNG DER ANGEWANDTEN ELEKTROPHYSIOLOGISCHEN METHODEN 28
2.2.2.1 DIE PATCH-CLAMP TECHNIK 28
2.2.2.1.1 DIE CELL-ATTACHED KONFIGURATION 29
2.2.2.1.2 DIE WHOLE-CELL KONFIGURATION 29
2.2.2.1.3 DIE INSIDE-OUT KONFIGURATION 30
2.2.2.1.4 DIE OUTSIDE-OUT KONFIGURATION 30
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IMAGE 2
2.2.2.1.5 DIE SPANNUNGSKLEMME 30
2.2.3 DER PATCH-CLAMP VERSUCHSSTAND 31
2.2.3.1 DIE MECHANISCHEN KOMPONENTEN 32
2.2.3.2 DIE DREIGLIEDRIGE VERSUCHSKAMMER ZUR AUFNAHME DER
VERSUCHSLOESUNGEN 33
2.2.3.3 MESSELEKTRODE UND NACHGESCHALTETE MESSELEKTRONIK 34
2.2.3.4 FERTIGUNG DER PATCH-PIPETTEN UND INTEGRATION IN DEN
VERSUCHSSTAND 35
2.2.4 DURCHFUEHRUNG DER ELEKTROPHYSIOLOGISCHEN EXPERIMENTE 36
2.2.5 VERWENDETE PULSPROTOKOLLE 37
2.2.5.1 PULSPROTOKOLL ZUR BESTIMMUNG DES TRANSIENTEN K + AUSWAERTSSTROMS
I T0 37
2.2.5.2 PULSPROTOKOLL ZUR BESTIMMUNG DER STEADY-STATE INAKTIVIERUNG VON
I T0 38
2.2.5.3 PULSPROTOKOLL ZUR BESTIMMUNG DER ERHOLUNG VON DER
INAKTIVIERUNG VON I T0 39
2.2.6 AUSWERTUNG 40
2.2.6.1 AUSWERTUNG DER ELEKTROPHYSIOLOGISCHEN EXPERIMENTE ZUR
BESTIMMUNG DES TRANSIENTEN K + AUSWAERTSSTROMS 40
2.2.6.1.1 BESTIMMUNG DER MITTLEREN STROM-SPANNUNGSBEZIEHUNG VON I T0 40
2.2.6.1.2 UNTERSUCHUNG DER INAKTIVIERUNG VON IT 0 41
2.2.6.1.3 BESTIMMUNG DER STROMKOMPONENTEN AMPO, AMPI UND AMP2
DER K + AUSWAERTSSTROEME 41
2.2.6.1.4 UNTERSUCHUNG DER AKTIVIERUNG VON K + STROEMEN 42
2.2.6.1.5 UNTERSUCHUNG DER STEADY-STATE INAKTIVIERUNG VON I T0 42
2.2.6.1.6 UNTERSUCHUNG DER ERHOLUNG VON DER INAKTIVIERUNG VON I T0 43
2.2.6.2 STATISTISCHE ANALYSEN DER MESSERGEBNISSE 43
2.3 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 44
2.3.1 VERSUCHSLOESUNGEN DER MOLEKULARBIOLOGISCHEN EXPERIMENTE 44
2.3.2 GEWEBEPRAEPARATION VON RATTENKARDIOMYOZYTEN FUER DIE
PROTEINISOLATION 44
2.3.3 PROTEINISOLATION 45
2.3.3.1 GESAMTPROTEINISOLATION 45
2.3.3.2 FRAKTIONIERUNG DER PROTEINE 45
2.3.3.2.1 DIE DIFFERENTIALZENTRIFUGATION: PRAEPARATION DER
MEMBRANFRAKTION 45
2.3.4 ZENTRIFUGATION IM SACCHAROSE-GRADIENTEN 46
2.3.5 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION 46
2.3.6 DENATURIERENDE PAAG-ELEKTROPHORESE UND WESTERN BLOT 47
2.3.7 PRIMAERE UND SEKUNDAERE ANTIKOERPER 47
IMAGE 3
2.3.8 AUSWERTUNG DER WESTERN BLOT ANALYSEN 48
2.4 GENEHMIGUNG DER TIERVERSUCHE 48
3 ERGEBNISSE 49
3.1 LOKALISATION KARDIALER K + KANAELE IN LIPID RAFTS 49
3.2 EINFLUSS EINER CHOLESTEROL-ENTFERNUNG AUF KARDIALE K + STROEME 52
3.2.1 EINFLUSS VON MSSCD AUF I T0 UND I SS IN ISOLIERTEN KARDIOMYOZYTEN
VON RATTEN 52
3.2.1.1 ZEITVERLAUF DES MSSCD EFFEKTS 55
3.2.1.2 ZEITLICHE CHARAKTERISIERUNG DER STROMGROESSEN I TO UND I SS
DURCH AMPO, AMPI UND AMP2 57
3.2.1.3 EINFLUSS AUF DIE KINETIK VON IT 0 60
3.2.2 EINSATZ VON 4-AMINOPYRIDIN UND TETRAETHYLAMMONIUMCHLORID ZUR
ANALYSE DER BETEILIGTEN STROMKOMPONENTEN 64
3.3 EFFEKT VON MSSCD AUF KARDIALE K + KANAELE IN ISOLIERTEN KARDIOMYOZYTEN
67
4 DISKUSSION 70
4.1 METHODOLOGISCHE LIMITATIONEN DER EXPERIMENTE MIT MSSCD 70
4.2 REDUKTION VON I TO DURCH MSSCD 71
4.2.1 DER EINFLUSS VON MSSCD AUF DIE KINETIK VON I T0 72
4.2.2 KY4.2/KCHIP2 LOKALISATION IN LIPID RAFTS 73
4.3 I SS ZUNAHME DURCH MSSCD 74
4.3.1 ZUNAHME DES LECKSTROMS ALS MOEGLICHE URSACHE DES I SS ANSTIEGS 74
4.3.2 DAS PROTEIN K V 1.5 75
4.3.3 DAS PROTEIN K V 2.1 76
4.3.4 K2P KANAELE ALS MOEGLICHKEIT FUER EINEN I SS ANSTIEG 77
4.3.5 UNSPEZIFISCHE EFFEKTE AUF K + KANAELE DURCH ZERSTOEREN DER LIPID
RAFTS 78
4.4 AUSBLICK 79
LITERATURVERZEICHNIS 80
ABBILDUNGSVERZEICHNIS 88
TABELLEN VERZEICHNIS 89
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 90
VEROEFFENTLICHUNGEN 92
DANKSAGUNG 93
LEBENSLAUF 95
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