Proteincharakterisierung am Beispiel von Apoptosemodulation durch Pockenviren und der Glykosylierung in Insektenzellen:
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INHALTSVERZEICHNIS
KURZFASSUNG V
ABSTRACT VII
1 EINLEITUNG 1
KAPITEL I APOPTOSEMODULATION DURCH POCKENVIREN 3
2 STAND DES WISSENS 3
2.1 POCKENVIREN 3
2.1.1 T A X O N O M I E 3
2.1.2 M O R P H O L O G I E 3
2.1.3 P O C K E N V I R E N G E N O M 4
2.1.4 P O C K E N V I R E N P R O T E O M 4
2.1.5 REPLIKATIONSZYKLUS D E R POCKENVIREN 5
2.2 A P O P T O S E 6
2.2.1 INTRINSISCHE SIGNALKASKADE 8
2.2.2 EXTRINSISCHE SIGNALKASKADE 9
2.2.3 A P O P T O S E M O D U L A T I O N D U R C H O R T H O P O C K E
N V I R E N 10
2.2.3.1 A P O P T O S E I N H I B I E R U N G D U R C H VIRALE
REPLIKATION 10
2.2.3.2 MITOCHONDRIEN-ASSOZIIERTE A P O P T O S E I N H I B I E R U N G
11
2.2.3.3 I N H I B I E R U N G D E R REZEPTOR-VERMITTELTEN A P O P T O S
E 11
2.2.3.4 CASPASEINHIBITOREN 11
2.3 MS-BASIERTE PROTEINIDENTIFIKATION 12
2.4 MALDI-TOF M S 13
2.4.1 M A L D I - A N W E N D U N G E N IN D E R PROTEINANAIYTIK 13
2.4.2 POST-SOURCE DECAY-FRAGMENTIERUNG 14
2.4.3 PEPTIDDERIVATISIERUNG M I T 4-SULFOPHENYLISOTHIOCYANAT 16
3 MATERIAL UND METHODEN 18
3.1 ZELLKULTUR U N D PROTEOMEXTRAKTION . 18
3.2 ZWEI-DIMENSIONALE-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 18
3.3 G E L A U S W E R T U N G 19
3.4 G E L E N T F AE R B U N G U N D INGEL-VERDAU M I T T R Y P S I N 19
3.5 PEPTIDEXTRAKTION 20
3.6 SPITC-DERIVATISIERUNG A N D E R FESTPHASE 20
3.7 INLOESUNGS-VERDAU M I T T R Y P S I N 20
- I -
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
3.8 SPITC-DERIVATISIERUNG IN L OE S U N G 20
3.9 MALDI C U R V E D FIELD REFLECTRON (CFR) TOF 21
4 ERGEBNISSE 23
4.1 ETABLIERUNG D E R SPITC-DERIVATISIERUNG 23
4.2 PROTEOMANALYSE POCKENIRIFIZIERTER H E K 293 ZELLEN 26
4.3 PROTEINIDENTIFIZIERUNG A M BEISPIEL V O N PROHIBITIN (PHB) 3 5
5 DISKUSSION 40
5.1 ETABLIERUNG D E R SPITC-PEPTIDDERIVATISIERUNG 40
5.2 PROTEOMANALYSE POCKENINFIZIERTER H E K 293 ZELLEN M I T 2D-SDS-PAGE
& MALDI-TOF M S 4 1
5.2.1 A) ENERGIESTOFFWECHSEL-RELEVANTE PROTEINE 4 1
5.2.2 B) PROTEINEXPRESSION-ASSOZIIERTE PROTEINE 42
5.2.3 C) APOPTOSE-RELEVANTE PROTEINE 4 3
5.2.4 D) VIRALE PROTEINE 4 4
5.2.5 E) SONSTIGE PROTEINE 45
6 RESUEMEE 46
K A P I T E L L I GLYKOSYLIERUNG IN INSEKTENZELLEN 47
7 STAND DES WISSENS 47
7.1 PROTEINGLYKOSYLIERUNG 4 7
7.1.1 N-GLYKOSYLIERUNG 4 8
7.1.2 O-GLYKOSYLIERUNG 5 1
7.1.3 BIOLOGISCHE U N D MEDIZINISCHE B E D E U T U N G D E R
GLYKOSYLIERUNG 5 3
7.1.4 BIOTECHNOLOGISCHE H E R S T E L L U N G V O N GLYKOPROTEINEN 54
7.1.5 G L Y K O P R O T E I N P R O D U K T I O N I N INSEKTENZELLEN 56
7.2 MODELLGLYKOPROTEINE 59
7.2.1 ERYTHROPOIETIN 59
7.2.2 INTERLEUKIN-4 61
7.3 GLYKOPROTEINANALYTIK 62
7.3.1 ENZYMATISCHE DEGLYKOSYLIERUNG 6 3
7.3.2 H Y D R O P H I L E INTERAKTIONSFLUESSIGKEITSCHROMATOGRAPHIE 6 5
7.3.3 MALDI QIT TOF MS 66
8 MATERIAL UND METHODEN 71
8.1 EXPRESSIONSVEKTOREN U N D ZELLKULTUR 71
8.1.1 EXPRESSIONSVEKTOR F UE R ERYTHROPOIETIN 71
- I I -
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
8.1.2 EXPRESSIONSVEKTOR F UE R INTERLEUKIN-4 71
8.1.3 SF21 INSEKTENZELLKULTUR 71
8.2 PROTEINCHEMISCHE M E T H O D E N 72
8.2.1 TCA-FALLUNG 72
8.2.2 ZELLLYSE 72
8.2.3 R E D U K T I O N U N D ALKYLIERUNG V O N DISULFIDBRUECKEN 72
8.2.4 SDS-PAGE 72
8.2.5 W E S T E R N BLOTTING 73
8.2.6 PROTEINKONZENTRATION 7 3
8.2.7 AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 74
8.2.8 PROTEINENTSALZUNG 74
8.2.9 INGEL-TRYPSM-VERDAU 74
8.2.10 PEPTIDEXTRAKTION 7 5
8.2.11 SPITC-DERIVATISIERUNG 75
8.2.12 E N D O P R O T E I N A S E V E R D A U I N L OE S U N G 75
8.2.12.1 GLU-C-VERDAU 75
8.2.12.2 T R Y P S I N - V E R D A U 75
8.2.12.3 PEPSIN-VERDAU 75
8.2.12.4 A S P N - V E R D A U 7 5
8.3 GLYKANANALYTIK 76
8.3.1 ENDOGLYKOSIDASE-VERDAU 76
8.3.1.1 INGEL-PNGASE F-VERDAU 76
8.3.1.2 INLOESUNGS-VERDAU M I T PNGASE F 76
8.3.1.3 INLOESUNGS-VERDAU M I T PNGASE A 76
8.3.1.4 ENDO-SS-N-ACETYLGLUCOSAMINIDASE F2, F3-VERDAU 76
8.3.1.5 EXOGLYKOSIDASE-VERDAU 77
8.3.2 F L U O R E S Z E N Z M A R K I E R U N G V O N FREIEN G L Y K A N
E N 78
8.3.3 A U F R E I N I G U N G V O N 2AB-MARKIERTEN G L Y K A N E N 78
8.3.4 HILIC-ANALYSE V O N G L Y K A N E N 78
8.3.5 E N Z Y M R E M O V E R 79
8.3.6 C A R B O G R A P H 79
8.4 MASSENSPEKTROMETRIE 8 0
8.4.1 M A L D I CFR TOF M S 80
8.4.2 M A L D I QIT TOF M S 80
8.4.3 M A L D I - P R O B E N P R AE P A R A T I O N 8 1
- I I I -
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
9 ERGEBNISSE 83
9.1 W E S T E R N BLOT V O N R H U E P O U N D RHUIL-4 8 3
9.2 A U F R E I N I G U N G V O N R H U E P O U N D RHUIL-4 84
9.3 PROTEINIDENTIFIZIERUNG V O N R H U E P O U N D RHUIL-4 86
9.4 B E S T I M M U N G D E R N-GLYKOSYLIERUNGSSTELLEN V O N R H U E P O
U N D RHUIL-4 94
9.5 B E S T I M M U N G D E R O-GLYKOSYLIERUNG V O N R H U E P O 98
9.6 N-GLYKANANALYTIK 101
9.6.1 HILIC & EXOGIYKOSIDASE-VERDAU BASIERTE N - G L Y K A N S E Q U E N
Z I E R U N G 102
9.6.2 M A L D I QIT TOF MS N B A S I E R T E - N - G L Y K A N S E Q U E
N Z I E R U N G 107
10 FEHLERDISKUSSION 118
10.1 P R O B E N V O R B E R E I T U N G U N D 2D-SDS-PAGE 118
10.2 PROTEINIDENTIFIZIERUNG M I T M A L I D CFR TOF M S N A C H
SPITC-PEPTID-DERIVATISIERUNG 118
10.3 R H U E P O U N D RHUIL-4 ISOLIERUNG U N D W E S T E R N
BLOT-IDENTIFIZIERUNG 118
10.4 G L Y K A N A U F R E I N I G U N G U N D F L U O R E S Z E N Z M A
R K I E R U N G 119
10.5 G L Y K A N S E Q U E N Z I E R U N G MITTELS HILIC U N D M A L D I
QIT TOF M S 119
11 DISKUSSION 120
11.1 EXPRESSIONSTEST 121
11.2 PROTEINAUFREINIGUNG 122
11.3 PROTEINIDENTIFIZIERUNG V O N R H U E P O U N D RHUIL-4 124
11.4 N-GLYKOSYLIERUNGSSTELLEN V O N R H U E P O U N D RHUIL-4 126
11.5 B E S T I M M U N G D E R O-GLYKOSYLIERUNGSSTELLE U N D O - G L Y K
A N S T R U K T U R V O N R H U E P O 127
11.6 N-GLYKANANALYTIK 128
11.6.1 HILIC & EXOGIYKOSIDASE-VERDAU BASIERTE N - G L Y K A N S E Q U E
N Z I E R U N G 128
11.6.2 M A L D I QIT TOF MS N B A S I E R T E N - G L Y K A N S E Q U E
N Z I E R U N G 131
12 RESUEMEE 134
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 135
ABBILDUNGSVERZEICHNIS 140
LITERATURVERZEICHNIS 142
ANHANG 154
- I V -
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