Untersuchung des differentiellen Transkriptoms von intaktem und destruiertem Knorpelgewebe des osteoarthrotischen Kniegelenks:
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Autor: Geyer, Matthias Florian
Jahr: 2009
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG 1
1.1 Genexpression und Arraytechnologie 1
1.2 Gelenk 3
1.3 Gelenkknorpelgewebe 4
1.4 Arthrose 6
1.4.1 Historische Entwicklung und Begriffsbestimmung 6
1.4.2 Einteilung, Ätiologien und Lokalisationen 7
1.4.3 Epidemiologie und Sozioökonomie 8
1.4.4 Pathogenese 10
1.4.5 Klinik und Diagnostik 10
1.4.6 Therapie und Prophylaxe 12
1.5 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit 14
2 MATERIAL 16
2.1 Gelenkresektate 16
2.2 Kits und Enzyme 17
2.3 Chemikalien und Reagenzien 18
2.4 Puffer und Lösungen 19
2.5 Primer und Nukleotide 20
2.6 Antikörper 20
2.7 Geräte, Instrumente und Gebrauchsgegenstände 21
2.8 Verbrauchsmaterialien 22
2.9 Software 22
2.10 Datenbanken 23
Inhaltsverzeichnis
3 METHODEN 24
3.1 Präparation des Untersuchungsmaterials 24
3.2 Vermählen der Knorpelstückchen 25
3.3 RNA-Isolierung 26
3.4 Alkoholpräzipitation 27
3.5 DNase-Verdau 27
3.6 Quantifizierung der RNA 28
3.6.1 Messung der Fluoreszenz mittels RiboGreen? 28
3.6.2 Messung der optischen Dichte durch UV-Absorptionsspektrometrie 28
3.7 Qualitätsüberprüfung der RNA 29
3.7.1 Agarosegelelektrophorese 29
3.7.2 Der RNA 6000 NanoAssay im Agilem 2100 Bioanalyzer 29
3.8 Reverse Transkription für die Microarray-Plattform 30
3.9 In-vitro-Transkription (IVT) zur cRNA-Synthese 31
3.10 Quantifizierung und Qualitätsüberprüfung der cRNA 32
3.11 Fragmentierung der cRNA 32
3.12 Beschreibung des verwendeten Arrayformates 32
3.13 Hybridisierung der cRNA auf die Arrays 35
3.14 Waschen, Färben und Scannen der Arrays 35
3.15 Low-level analysis 36
3.15.1 Single Array Analysis 36
3.15.2 Comparison Analysis 38
3.16 High-level analysis 39
3.16.1 Filtern von Genen 39
3.16.2 Clusteranalyse 40
3.16.3 Pathway-Analysen 41
3.17 Synthese genspezifischer Primer 42
3.18 Reverse Transkription (RT) für Polymerasekettenreaktionen 42
Inhaltsverzeichnis
3.19 Konventionelle Polymerasekettenreaktion (PCR) 43
3.20 Agarosegelelektrophorese von DNA 44
3.21 Quantitative Polymerasekettenreaktion 44
3.22 Konventionelle Histologie 45
3.23 Immunhistologie 45
4 ERGEBNISSE 47
4.1 Etablieren der Methodik zur RNA-Extraktion 47
4.1.1 Mechanische Vorbehandlung des Gewebes 47
4.1.2 Verschiedene Isolierungsverfahren 47
4.2 Quantität und Qualität der isolierten Gesamt-RNA 50
4.3 Menge und Güte der synthetisierten cRNA 51
4.4 Qualitätsparameter der Microarray-Experimente 52
4.4.1 Kontrolloligonukleotid B2 52
4.4.2 Skalierungsfaktoren 52
4.4.3 Prozentsatz der als Present gewerteten Probe Sets 52
4.4.4 Verhältnis der 3 -zu 5 -Signale der internen Kontrollen 53
4.5 Statistische Verteilung der differentiellen Expressionswerte 53
4.6 Differentiell exprimierte Gene 55
4.6.1 Hochregulierte Gene 56
4.6.2 Herunterregulierte Gene 67
4.7 PCR-Experimente 76
4.7.1 Konventionelle PCR 76
4.7.2 Quantitative PCR 77
4.8 Histologische Untersuchungen 78
4.8.1 Konventionelle Histologie 78
4.8.2 Immunhistologie 78
4.9 Cluster-Analysen 83
4.10 Pathway-Analysen 87
Inhaltsverzeichnis
5 DISKUSSION 92
5.1 Einteilung der Areale 92
5.2 Mechanische Vorbehandlung des Gewebes 93
5.3 Die RNA 93
5.3.1 Extraktion aus Knorpelgewebe 93
5.3.2 Quantifizierung 94
5.3.3 Qualitätsbestimmung 94
5.3.4 Güte der isolierten Gesamt-RNA 95
5.4 GeneChip-Analysen 96
5.4.1 Qualitative Bewertung der Array-Experimente 96
5.4.2 Algorithmen und Filterkriterien 96
5.4.3 Cluster-Verfahren 97
5.5 Validierung mittels qPCR und Immunhistologie 98
5.6 Die sechs bei allen fünf Patienten hochregulierten Gene 99
5.6.1 IGFBP-3 (Insulin-like growth factor-binding protein 3) 99
5.6.2 WISP-1 (Wnt-1-induced signaling pathway protein 1) 100
5.6.3 AQP-1 (Aquaporin 1) 101
5.6.4 DNER (Delta/Notch-like EGF-repeat containing transmembrane) 103
5.6.5 DAF (Decay-accelerating factor) 103
5.6.6 IF (I factor, factor I, conglutinogen-activating factor) 104
5.7 Pathway-Analysen 104
5.8 Diskussion weiterer Gene 110
6 ZUSAMMENFASSUNG 111
LITERATURVERZEICHNIS 112
EIGENE VERÖFFENTLICHUNGEN 125
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 126
BILDERVERZEICHNIS 129
TABELLENVERZEICHNIS 130
Inhaltsverzeichnis
DANKSAGUNG 131
LEBENSLAUF 133
EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG 134
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