Sphäroid-Analytik: Evaluierung Fluoreszenz-basierter Zytotoxizitäts-Assays und Darstellung des Auswachsverhaltens:
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2008
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
/. Einleitung 6
1.1 Das multizelluläre (Tumor-) Sphäroid-Modell (MCTS) 6
1.1.1 Rückblick 6
1.1.2 Histopathomorphologie und Pathophysiologie multizellulärer Sphäroide 6
1.1.3 Verschiedene Techniken zur Bildung und Kultivierung dreidimensionaler Zellaggregate 10
12 Multizelluläre Tumorsphäroide in der Therapieforschung 12
1.2.1 Einsatz des Modellsystems in der Strahlentherapie 12
1.2.2 Einsatz des Modellsystems in anderen Bereichen experimenteller Therapien 13
1.2.3 Multizelluläre Tumorsphäroide in der Anti-Tumor-Wirkstofftestung 14
1.3 Aufgabenstellung und Zielsetzung der Arbeit 15
2. Material und Methoden 17
2.1 Materialien und Geräte 17
2.1.1 Verwendete Zelllinie 17
2.1.2 Zellkulturmedien, -puffer und -lösungen 17
2.1.3 Chemikalien und Assays 18
2.1.4 Verbrauchsmaterialien und Plastikartikel 18
2.1.5 Geräte 19
23, Methoden der Zellkultivierung 20
2.2.1 Kultivierung von Monolayer-Stammkulturen 20
2.2.2 Kultivierung von Monolayer-Zellen in 96-Well-Mikrotiterplatten 20
2.2.3 Kultivierung von Sphäroiden in „Liquid Overlay 21
23 Grundlegende Methoden der Sphäroidanalytik 21
2.3.1 Bestimmung von Sphäroiddurchmesser und -Volumen 21
2.3.2 Zellzahlbestimmung 22
2.4 Analyse des Auswachsverhaltens von Sphäroiden 23
2.4.1 Versuchsplanung und Durchfuhrung 23
2.4.2 Auswertung 24
2.5 Assays zur Bestimmung der Zytotoxirität bzw. der Zellvitalität 25
2.5.1 Grundlagen der Fluoreszenzanalytik mittels Fluoreszenz-Reader Fusion 26
2.5.2 CellTiter-Blue~ Cell Viability Assay 27
2.5.2.1 Theoretische Grundlagen 27
2.5.2.2 Einsatz an Monolayer- und Sphäroidkulturen 28
2.5.3 Vybrant* Cytotoxicity Assay Kit 28
2.5.3.1 Theoretische Grundlagen 28
2.5.3.2 Einsatz an Monolayerkulturen 29
2.5.3.3 Einsatz an Sphäroidkulturen 30
2.5.4 LIVE/DEAD* Viability/Cytotoxicity Kit 30
2.5.4.1 Theoretische Grundlagen 30
2.5.4.2 Einsatz an Monolayerkulturen 30
2.5.4.3 Einsatz an Sphäroidkulturen 31
2.5.5 CytoTox-ONE™ Homogeneous Membrane Integrity Assay 32
2.5.5.1 Theoretische Grundlagen 32
2.5.5.2 Einsatz an Monolayerkulturen 33
2.5.5.3 Einsatz an Sphäroidkulturen 33
2.5.6 Propidiumjodid-Färbung 34
2.5.6.1 Theoretische Grundlagen 34
2.5.6.2 Durchführung 35
3. Ergebnisse . 36
3.1 Auswachsverhalten von HT29-Kolonkarzinomzeu eii aus Sphäroidkulturen 36
3.1.1 Austestung verschiedener Oberflachenbeschichtungen 36
4
3.1.1.1 Sphäroide mit einem Durchmesser von 500 (im in Standardmedium 36
3.1.1.2 Sphäroide mit einem Durchmesser von 500 Mm in Alternativmedien 39
3.1.2 Einsatz von Sphäroiden unterschiedlicher Größe 42
3.1.2.1 Auswachskinetik auf Fibronektin 42
3.1.2.2 Auswachskinetik auf Kollagen I 44
3.1.3 Überblick 47
3.2 Vltalltäts- und Zytotoxizltätsassays 48
3.2.1 Sphäroidcharalcteristika und Totzettanteil 48
3.2.2 CellTiter-Blue™ Cell Viability Assay 52
3.2.3 Vybrant* Cytotoxicity Assay Kit 52
3.2.3.1 Bestimmung des Totzellanteils in HT29-Monolayerkulturen 53
3.2.3.2 Evaluation und Modifikation des Assays zum Einsatz an Sphäroidkulturen 53
3.2.4 LIVE/DEAD* Viability/Cytotoxicity Kit 55
3.2.4.1 Bestimmung des Totzellanteils in HT29-Monolayerkulturen 57
3.2.4.2 Evaluation und Modifikation des Assays zum Einsatz an Sphäroidkulturen 57
3.2.4.3 Einsatz des^ Assays an Sphäroid-Kulturen unterschiedlicher Größe 58
3.2.5 CytoTox-ONE™ Homogeneous Membrane Integrity Assay 60
3.2.5.1 Bestimmung des Totzellanteils in HT29-Monolayer-Kulturen 60
3.2.5.2 Evaluation und Modifikation des Assays zum Einsatz an Sphäroidkulturen 64
3.2.5.3 Weiterfahrende Testung zur Optimierung des Assays an Sphäroid-Kulturen mit einem
Durchmesser von 400 um . 65
3.2.5.4 Testung des Assays an Sphäroid-Kulturen mit einem Durchmesser über 500 um 70
4. Diskussion 75
4.1 Auswachsverhalten 77
4.1.1 Grundlegende Überlegungen zum Parameter .Auswachsverhalten 77
4.1.2 Grundlegende Überlegungen zur Oberflächenbeschichtung 78
4.1.3 Beurteilung des Auswachsverhaltens von HT29-Tumorsphäroiden auf Fibronektin und Laminin _ 79
4.1.4 Beurteilung des Auswachsverhaltens von HT29-Tumorsphäroiden auf Kollagen I 82
4.1.5 Methodische Betrachtung und Ausblick 83
4X Zellvitalitäts- und Zytotoxizitätsassays 84
4.2.1 Grundlegende methodische Betrachtung 85
4.2.1 Refcrenzwertbestimmung_ . 88
4.2.3 Vybrant* Cytotoxicity Assay Kit 89
4.2.4 CytoTox-One* Homogeneous Membrane Integrity Assay 90
4.2.5 LIVE/DEAD* Viability/Cytotoxicity Kit 94
4.2.6 Ausblick 95
5. Zusammenfassung 96
6. Anhang 99
7. Literaturverzeichnis 104
5
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