Chips und ASAP1: funktionelle Genomik der Tumormetastasierung
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| Format: | Hochschulschrift/Dissertation Buch |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Karlsruhe
FZKA
2005
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WISSENSCHAFTLICHE BERICHTE FZKA 7159 CHIPS UND ASAP1: FUNKTIONEILE
GENOMIK DER TUMORMETASTASIERUNG THOMAS MUELLER INSTITUT FUER TOXIKOLOGIE
UND GENETIK VON DER FAKULTAET FUER CHEMIE UND BIOWISSENSCHAFTEN DER
UNIVERSITAET KARLSRUHE (TH) GENEHMIGTE DISSERTATION FORSCHUNGSZENTRUM
KARLSRUHE GMBH, KARLSRUHE 2005 ULB DARMSTADT IIIIILLLLLLLLLLL 16249297
INHALTSVERZEICHNIS 1. EINLEITUNG 1 1.1 VORBEMERKUNG 1 1.2 KREBS 1 1.3
METASTASEN 2 1.4 DIE METASTATISCHE KASKADE 2 1.5 ADHAESION, INVASION UND
MOTILITAET VON TUMORZELLEN 4 1.5.1 EMT (EPITHELIALER-ZU-MESENCHYMALER
UEBERGANG) 4 1.5.2 ADHAESION 4 1.5.3 PROTEOLYSE 6 1.5.4 MIGRATION 7 1.5.5
TUMORE UND ANGIOGENESE 7 1.5.6 LYMPHANGIOGENESE 8 1.6 ZU DIESER ARBEIT 8
1.6.1 ZUGRUNDE LIEGENDE HYPOTHESE 8 1.6.2 SSH - SUBTRAKTIVE SUPPRESSIVE
HYBRIDISIERUNG 9 1.6.3 TUMORPROGRESSIONSSYSTEME 10 1.6.3.1 DAS
BSP73-RATTENADENOKARZINOMSYSTEM (PANKREAS) 10 1.6.3.1.1BESTAETIGUNG DES
METASTATISCHEN POTENTIALS DER BSP73-ZELLLINIEN 11 1.6.3.2 DAS
13762NF-RATTENADENOKARZINOMSYSTEM (BRUST) 12 1.6.3.3 DAS DUNNING R3327
RATTENADENOKARZINOMSYSTEM (PROSTATA) 12 1.6.4 HINTERGRUND DER BEIDEN ZU
UNTERSUCHENDEN SUBTRAKTIVEN BIBLIOTHEKEN 14 1.6.5 DNA-MIKROARRAYS 15
1.6.6 CHARAKTERISIERUNG EINES METASTASEN-ASSOZIIERTEN GENS 16
1.6.6.1ARF-GAP-FAMILIE (CENTAURINE) 16 1.6.6.2ARF-PROTEINE 16
1.6.6.3AUFBAU VON ASAP1 17 1.6.6.4 FUNKTIONEN VON ASAP1 IN DER ZELLE 17
1.7 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT 19 2. MATERIAL UND METHODEN 21 2.1
BEZUGSQUELLEN DER CHEMIKALIEN UND VERBRAUCHSMATERIALIEN 21 2.2 GERAETE 23
2.3 RADIOCHEMIKALIEN 24 2.4 ANTIKOERPER 24 2.4.1 PRIMAERANTIKOERPER: 24
2.4.2 SEKUNDAERANTIKOERPER: 24 2.5 PLASMIDE 24 2.6 OLIGONUKLEOTIDE 24 2.7
PRO- UND EUKARYOTISCHE ZELLLINIEN 25 2.7.1 PROKARYOTISCHE ZELLEN: 25
2.7.2 EUKARYOTISCHE ZELLEN: 25 2.8 DNA-METHODEN 26 2.8.1
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN 26 INHALTSVERZEICHNIS V 2.8.2
PHENOL/CHLOROFORM EXTRAKTION 26 2.8.3 FAELLUNG VON NUKLEINSAEUREN 26 2.8.4
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 26 2.8.5 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS
AGAROSEGELEN 26 2.8.6 PLASMID DNA MINI-PRAEPARATION 27 2.8.7 PLASMID-DNA
MAXI-PRAEPARATION 27 2.8.8 PCR-ANSAETZE 27 2.8.9 SCHNEIDEN VON DNA MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 28 2.8.10 DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA 28 2.8.11
LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN 28 2.8.12 TOPO-KLONIERUNG 29 2.8.13
RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON CDNA 29 2.9 GEBRAUCH EINES MATCHED
TUMOR/NORMAL EXPRESSION ARRAY 29 2.10 PRAEPARATION ELEKTROKOMPETENTER
BAKTERIEN 29 2.11 TRANSFORMATION DURCH ELEKTROPORATION: 29 2.12 RNA
METHODEN 30 2.12.1 PRAEPARATION VON GESAMT-RNA AUS ZELLEN UND GEWEBE 30
2.12.2 PRAEPARATION VON POLYA-I- -RNA AUS ZELLEN 30 2.12.3 RNA - AGAROSE
- GELELEKTROPHORESE 30 2.12.4 NORTHERN BLOT: TRANSFER VON RNA AUF
NYLONMEMBRAN 31 2.12.5 NORTHERN-HYBRIDISIERUNG 31 2.12.6 HERSTELLUNG VON
CDNA AUS POLYA+ -RNA 31 2.12.7 IN SITU HYBRIDISATION 32 2.13 METHODEN
FUER DIE HERSTELLUNG UND BENUTZUNG VON DNA-MIKROARRAYS 32 2.13.1
REINIGUNG DES AMPLIKONS UND KONTROLLE DER PCR-REAKTION 32 2.13.2VORLAGE
IN 384-WELL MIKROTITERPLATTEN FUER DEN KONTAKTSPOTTER 32 2.13.3
FLUORESZENZMARKIERUNG VON DNA UND HYBRIDISIERUNG 32 2.13.4
HYBRIDISIERUNG 33 2.13.5WASCHEN DER MIKROARRAYS 33 2.13.6 AUSLESEN MIT
DEM AXON 4000B 33 2.13.7 STATISTISCHE AUSWERTUNG 34 2.14 PROTEINMETHODEN
35 2.14.1 PRAEPARATION VON ZELLEN UND GEWEBE FUER PROTEINGELE 35
2.14.2AUFTRENNUNGVON PROTEINEN IN SDS-POLYACRYLAMIDGELEN (SDS-PAGE) 35
2.14.3COOMASSIE-BRILLIANT-BLAU-FAERBUNG VON PROTEINEN NACH SDS-PAGE 35
2.14.4 ANALYSE VON PROTEINEN DURCH TRANSFER AUF MEMBRANEN UND DETEKTION
DURCH SPEZIFISCHE ANTIKOERPER (WESTERN BLOT) 36 2.14.5 RADIOAKTIVE
IMMUNPRAEZIPITATION VON PROTEINEN (HOT-IP) 36 2.14.6 ELISA (ENZYME-IINKED
IMMUNOSORBENT ASSAY) 37 2.14.7 IMMUNFLUORESZENZFAERBUNG VON PROTEINEN 37
2.14.8 IMMUNHISTOCHEMIE 37 2.15 ANTIKOERPERPRODUKTION UND AUFREINIGUNG 38
2.15.1 AUFREINIGUNG DES HUASAPL-GST-FUSIONSPROTEINS 38 2.15.2
IMMUNISIERUNG VON MAEUSEN ZUR HERSTELLUNG MONOKLONALER ASAPL-ANTIKOERPER
39 2.15.3VORBEREITUNGDER HYBRIDOM-BILDUNG 39 2.15.4 HYBRIDOM-BILDUNG 39
2.15.5TESTEN DER KLONE 40 VI INHALTSVERZEICHNIS 2.15.6AUFREINIGUNG DER
ANTIKOERPER 40 2.16 BENUTZUNG EINES SH3 TRANSIGNAL SH3 DOMAIN ARRAY 40
2.17 ZELLKULTURMETHODEN 40 2.17.1 PASSAGIEREN VON ZELLEN 40 2.17.2
EINFRIEREN UND AUFTAUEN VON ZELLEN 40 2.17.3STABILE UND TRANSIENTE
TRANSFEKTIONEN MIT GENEPORTER 41 2.17.4ERMITTLUNG DER
TRANSFEKTIONSEFFIZIENZ 41 2.18FUNKTIONELLE IN VITRO METHODEN 41
2.18.1WUNDHEILUNGSEXPERIMENT (KRATZASSAY) 41 2.18.2ADHAESIONSEXPERIMENTE
42 2.18.3 PROLIFERATIONSEXPERIMENTE 42 2.18.4 ERMITTLUNG DER
APOPTOSERATE 42 2.19 TIERMETHODEN 42 2.19.1TUMORWACHSTUM UND
METASTASIERUNGSEXPERIMENTE IN RATTEN 43 3. ERGEBNISSE 45 3.1
CHARAKTERISIERUNG ZWEIER SUBTRAKTIVER BIBLIOTHEKEN 45 3.1.1
DNA-MIKROARRAY-DESIGN 45 3.1.2 AMPLIFIZIERUNG UND AUFREINIGUNG DER
SSH-KLONE 46 3.1.3 SPOTTEN DER SSH-KLONE AUF DIE GLASCHIPS 47 3.1.4
AUSWAHL DER ZELLLINIEN FUER DIE HYBRIDISATION DER DNA-MIKROARRAYS 48
3.1.5 HYBRIDISATION UND AUSWERTUNG DER DNA-ARRAYS 49 3.2
CHARAKTERISIERUNG VON ASAP1 51 3.2.1 DIFFERENTIELLE EXPRESSION VON ASAP1
IN RATTENTUMORPROGRESSIONSMODELLEN 51 3.2.2 ASAPL-EXPRESSIONSSTUDIEN IN
HUMANEN TUMOREN IM VERGLEICH ZU NORMALGEWEBEN 52 3.2.3 IN SITU
HYBRIDISATION VON MENSCHLICHEN TUMORSCHNITTEN MIT FLUORESZENZ-MARKIERTER
ASAPL-MRNA 55 3.2.4 HERSTELLUNG MONOKLONALER ANTI-ASAPL-ANTIKOERPER 57
3.2.4.1 PRAEPARATION EINES ASAPL-GST-FUSIONSPROTEINS 57 3.2.4.2TESTEN DER
IN DEN HYBRIDOMUEBERSTAENDEN ENTHALTENEN ANTIKOERPER 57 3.2.5.
CHARAKTERISIERUNG DER MONOKLONALEN ANTI-ASAPL-ANTIKOERPER 58 3.2.5.1
STRIP WESTERNS MIT AUFGEREINIGTEM PROTEIN ZUM TESTEN DER ANTI-ASAPL-
ANTIKOERPER 59 3.2.5.2 EXPRESSION VON ASAP1 IN MENSCHLICHEN
KOLONKARZINOMZELLEN 60 3.2.5.3 MONOKLONALE ANTI-HUMAN-ASAPL-ANTIKOERPER
KREUZREAGIEREN MIT RATTEN-ASAPL 60 3.2.5.4 DIFFERENTIELLE EXPRESSION VON
ASAP1 IM BSP73 PANKREASSYSTEM DER RATTE 61 3.2.5.5 IMMUNPRAEZIPITATION
VON ASAP1 61 3.2.5.6 BESTIMMUNG DER LOKALISATION VON ASAPL-PROTEIN IN
DER ZELLE UEBER IMMUNFLUORESZENZ 62 3.2.5.7 IMMUNOHISTOCHEMIE (IHC) MIT
MONOKLONALEN ANTI-ASAPL-ANTIKOERPERN AUF HUMANEN
SW1116-KOLONKARZINOM-TUMORSCHNITTEN 64 3.2.5.8 IMMUNOHISTOCHEMIE (IHC)
MIT MONOKLONALEN ANTI-ASAPL-ANTIKOERPERN AUF ASML- RATTENTUMORSCHNITTEN
66 3.2.5.9ZUSAMMENFASSUNG DER ANTI-ASAPL-ANTIKOERPER-CHARAKTERISIERUNG 67
3.2.6 IMMUNOHISTOCHEMISCHE ANALYSEN MENSCHLICHER TUMOR-/NORMALGEWEBE
ZEIGEN, DASS ASAP1 IN TUMOREN HOCHREGULIERT IST. 68 3.2.7. ISOLATION DER
KOMPLETTEN LAENGE DER RATTEN-ASAPL-CDNA 70 3.2.7.1. 5 - RACE 70 3.2.7.2.
IDENTIFIKATION DREIER SPLEISSVARIANTEN VON RASAPL 72 INHALTSVERZEICHNIS
VII 3.2.8 FUNKTIONELLE ANALYSEN VON ASAPL 74 3.2.8.1 HINTERGRUND ZU DEN
ASAPL-KONSTRUKTEN 74 3.2.8.2. ADHAESION 75 3.2.8.2.1TRANSIENT
TRANSFIZIERTES RASAPL ERHOEHT DIE ADHAESION VON LAS-TUMORZELLEN ZU
FIBRONEKTIN 77 3.2.8.3 ZELLSTRECKUNG IN VITRO 79 3.2.8.4 IN VITRO
WUNDHEILUNGSVERSUCH 80 3.2.8.5. PROLIFERATION 82 3.2.8.6 APOPTOSE 86
3.2.9. IDENTIFIKATION VON ASAPL-INTERAKTIONSPARTNERN ANHAND EINES
SH3-DOMAIN-ARRAYS 88 3.2.10TIERVERSUCHE ZUR IN VIVO ANALYSE VON MIT
ASAPL-KONSTRUKTEN STABIL TRANSFIZIERTEN 1AS- UND ASML-RATTENTUMORZELLEN
90 3.2.10.1GENERATION STABIL TRANSFIZIERTER ASAPL UEBEREXPRIMIERENDER
ZELLLINIEN 90 3.2.10.2. IN VIVO ANALYSE VON MIT ASAPL-KONSTRUKTEN STABIL
TRANSFIZIERTEN 1AS- RATTEN- TUMORZELLEN 92 3.2.10.3 IN VIVO ANALYSE VON
MIT ASAPL-KONSTRUKTEN STABIL TRANSFIZIERTEN ASML-RATTEN- TUMORZELLEN 96
4. DISKUSSION 99 4.1 CHARAKTERISIERUNG ZWEIER SUBTRAKTIVER BIBLIOTHEKEN
DURCH DNA-MIKROARRAYS 99 4.2 IDENTIFIKATION METASTASEN-ASSOZIIERTER GENE
99 4.3 CHARAKTERISIERUNG DES METASTASEN-ASSOZIIERTEN GENS ASAPL 101
4.3.1 ASSOZIATION DER ASAPL-EXPRESSION ZUM NEOPLASTISCHEN PHAENOTYP 101
4.3.2 MODULATIONEN FUER DIE METASTASIERUNG WICHTIGER ZELLFUNKTIONEN DURCH
ASAPL 101 4.3.3 BEEINFLUSSUNG DES METASTATISCHEN PHAENOTYPS DURCH ASAPL
101 4.4 MOEGLICHE MECHANISMEN DER TUMORPROGRESSION UND METASTASIERUNG 102
5. LITERATURVERZEICHNIS A-L ABBILDUNGEN UND TABELLEN A-XL VIII
INHALTSVERZEICHNIS
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