Einfluss von exogenen und endogenen Danger-Signalen auf die T-Zelltoleranz gegen renale und pankreatische Autoantigene:
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis Seile 1
Inhaltsverzeichnis
I Abkürzungen IV
1 Einfahrung 1
1.1 Das erworbene Immunsystem 2
1.2 Der T Zell Rezeptorkomplex 2
1.3 MHC Restriktion bei der Erkennung von Antigenen durch T Zellen 3
1.4 Die Crosspräsentation als dritter Weg der Antigenpräsentation 4
1.5 Beeinflussung der T Zell Antigenerkennung durch genetischen Polymorphismus
der MHC Moleküle 6
1.6 Die Antigenpräsentierenden Zelten 7
1.6.1 Dendritische Zellen 8
1.7 Lebenszyklus der T Lymphozyten 10
1.8 Toll like Rezeptor Liganden 12
1.9 Mechanismen der T Zelltoleranz 16
1.10 Vorstellungen über die Brechung von T Zelltoleranz 17
1.11 Das RIP mOVA Modell 19
1.12 Das Modell dernephrotoxischen Nephritis 21
1.13 Fragestellungen der vorliegenden Arbeit 23
2 Material und Methoden 24
2.1 Chemikalien 24
2.1.1 Toll like Rezeptorliganden 24
2.1.1.1 PBS 9mM Phosphat gepufferte isotonische Salzlösung für Mäuse 24
2.2 Zellkultur Standardtechniken 25
2.2.1 Zellzählung 25
2.2.2 Aufzucht von Hybndomzellen 25
2.2.2.1 Zellkulturmedium zur Aufzucht von Hybridomzellen 25
2.3 Durchflusszytometrie 25
2.3.1 Oberflächenfärbung zur durchflusszytometrisehen Analyse 26
2.3.1.1 Herstellung des FACS Puffers 26
2.3.2 Intrazelluläre Färbung zur durchflusszytometnschen Analyse 26
2.4 Versuchstierexperimenteile Techniken 26
2.4.1 Injektionstechniken, Blutabnahmetechniken, Tötung der Versuchsmäuse 26
2.4.2 Bestimmung von Glukosurie, Kreatinin und Harnstoff..... 27
2.4.3 Bestimmung von Proteinurie 27
2.4.4 Bestimmung der Albumin Konzentration durch Elisa Analyse 27
2.4.5 Bestimmung der Hsp60 Konzentration durch Westem blot Analyse 27
2.4.6 Materialien und Techniken zur Nephritisinduktion 29
2.4.7 T Zelldepletion in Versuchsmäusen 29
Inhaltsverzeichnis Seite II
2.5 Haltung und Screening der verwendete Mauslinien im Tiermodell 29
2.5.1 RIP mOVA Mäuse 30
2.5.1.1 Genotypisierung der RIP mOVA Mäuse mittels PCR 30
2.5.2 OT I Mäuse 31
2.6 Zelltransfer Techniken 32
2.6.1 Präparation von OT I Zellen für den adoptiven Transfer 32
2.6.2 Bestimmung der transferierten OT I Zellen im Blut von Empfangermäusen 32
2.6.2.1 Erythrozyten Entfernungspuffer 32
2.6.3 Bestimmung der transferierten OT I Zellen in den lymphatischen Organen
von Empfangermäusen 32
2.6.4 Second Transfer von OT I Zellen 33
2.7 Messung von T Zell Proliferation in vivo mittels durchflusszytometrischer
CFSE Analyse 33
2.8 Präparation von DCs aus sekundär lymphatischen Organen 35
2.8.1 Herstellung von Miltenyi Puffer 36
2.9 Herstellung von Knochenmark Chimären durch Knochenmark Transplantation 36
2.10 Histologien 37
2.10.1 Standardhistologie 37
2.10.2 Immunhistologische Färbung für Insulin 37
2.10.2.1 Herstellung der Substrat Lösung 38
2.10.2.2 Histologische Auswertung der Pankreasinfiltration 38
2.10.3 Immunhistologische Färbung für CDUc 39
2.10.4 Immunhistologische Färbung für MHC II 39
2.10.4.1 Auszählung der immunhistologisch gefärbten Zellzahl 39
2.10.5 Immunhistologische Färbung für Fibrinogen 40
2.10.5.1 Histologische Auswertung der nephrotoxischen Nephritis 40
2.11 Statistische Auswertung 40
3 Ergebnisse 41
3.1 Fragestellung 1: Welchen Einfluss haben exogene Danger Signale
aufdieT Zelltoleranz? 41
3.1.1 Diabetesinzidenz in Abhängigkeit von der Anwesenheit von TLR Liganden 41
31 2 Titration der OT I Zellen, die nach Koinjektion des TLR2 Liganden
ParrßCys noch Autoimmundiabetes induzieren können 42
31 3 Beeinflussung der initialen Proliferation der naiven OT I Zellen durch Pam3Cys 43
3.1.4 Beeinflussung der Rezirkulation von geteilten OT I Zellen in
nicht drainierende Lymphknoten durch Pam3Cys 44
3.1.5 Konzentration der OT 1 Zellen im peripheren Blut unter dem Einfluss
von Pam3Cysbei Auftreten von Autoimmundiabetes 45
3.1.6 Einfluss von Pam3Cys auf das Oberleben von OT I Zellen 46
3.1.7 Einfluss von Pam3Cysauf die Kostimulationsmolekül Expression der DCs 49
Inhaltsverzeichnis Seite III
3.1.8 Einfluss von Pam3Cys auf den geweblichen Aufenthalt von DCs 50
3.2 Fragestellung 2: Sind die untersuchten Einflüsse der exogenen Danger Signale
auf die T Zelltoleranz an eine Signaltransduktion über Toll like Rezeptoren
gebunden? 52
3.2.1 Einfluss von Pam3Cys auf die Kostimulationsmolekül Expression der DCs
von TLR2 Mäusen 52
3.2.2 Diabetesinduktion in TLR2 .B6 » RlP.mOVA.B6 Knochenmark Chimären 52
3.3 Fragestellung 3: Haben auch endogene Danger Signale einen Einfluss auf
die T Zelltoleranz? 55
3.4 Fragestellung 4: Lassen sich immun vermittelte Erkrankungen durch den
Einfluss von endogenen Danger Signalen aggravieren? 58
3.4.1 Etablierung der Nephritismodelle 58
3.4.1.1 Nephrotoxische Nephritis 58
3.4.1.2 Ureterligatur Modell 60
3.4.1.3 Überlaufproteinurie 61
3.4.2 Bestimmung der Hsp60 Konzentration im Urin von Mäusen mit
nephrotoxischer Nephritis 63
3.4.3 Bestimmung der Hsp60 Konzentration im Inkubationsüberstand der Nieren
von Mäusen mit nephrotoxischer Nephritis 64
3.4.4 Einfluss des lokal freigesetzten Hsp60 auf die Aktivierung der Nieren DCs
bei nephrotoxischer Nephritis 66
3.4.5 Einfluss von HspöOauf den Verlauf der nephrotoxischen Nephritis 67
3.4.6 Die Rolle der T Lymphozyten bei der Aggravierung der nephrotoxischen
Nephritis durch Hsp60 71
4 Diskussion 73
5 Zusammenfassung , 80
6 Quellen Verzeichnis 81
]] Danksagung V
III Lebenslauf. VI
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