Verfügbarkeit: Funktionelle Untersuchungen zur Rolle des "transframe"-Proteins p6* bei der Replikation von HIV-1

Funktionelle Untersuchungen zur Rolle des "transframe"-Proteins p6* bei der Replikation von HIV-1: Bedeutung der Proteasespaltstellen von p6* für die virale Maturation und Infektiosität

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Bibliographische Detailangaben
Beteilige Person:	Ludwig, Christine 1972- (VerfasserIn)
Format:	Hochschulschrift/Dissertation Buch
Sprache:	Deutsch
Veröffentlicht:	Regensburg 2003
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adam_text	INHALTSVERZEICHNIS ABKUERZUNGEN.V ZUSAMMENFASSUNG.1 A EINLEITUNG.4 A.1 DIE ROLLE DER HIV-1 PROTEASE BEI DER VIRUSMORPHOGENESE.4 A.1.1 REPLIKATIONSZYKLUS VON HIV-1. 4 A.1.2 PROTEASE-VERMITTELTE EREIGNISSE.7 A.1.3 BIOSYNTHESE DER HIV-1 PROTEASE.9 A.2 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER HIV-1 PROTEASE.10 A.2.1 STRUKTUR UND STABILITAET.10 A.2.2 KATALYTISCHER MECHANISMUS.14 A.2.3 SUBSTRATSPEZIFITAET. 15 A.3 DIE HIV-1 PROTEASE ALS TARGET FUER THERAPEUTISCHE ANSAETZE.17 A.4 DIE REGULATION DER HIV-1 PROTEASE.19 A.4.1 REGULATION DER PROTEASE-AKTIVIERUNG.19 A.4.2 PROZESSIERUNG VON GAG UND GAG-POL.21 A. 4.3 EINFLUSS DES YYTRANSFRAME"-PROTEINS P6* AUF DIE PROTEASE-AKTIVITAET.24 A.4.3.1 STRUKTURELLE CHARAKTERISIERUNG VON P6.24 A. 4.3.2 P6 ALS MOEGLICHER INHIBITOR DER VIRALEN PROTEASE.25 A. 5 ZIELSETZUNG DER ARBEIT.26 B MATERIAL UND METHODEN.28 B. 1 KLONIERUNGEN UND GENTECHNISCHE ARBEITEN.28 B. 1.1 BAKTERIEN.28 B.1.2 OLIGONUKLEOTIDE.29 B.1.3 PLASMIDE.30 B. 1.3.1 HERSTELLUNG DER YYFRAMESHIFT"-REPORTERKONSTRUKTE.30 B.1.3.2 HERSTELLUNG DER PROKARYONTISCHEN GST-P6-EXPRESSIONSPLASMIDE.32 B.1.3.3 HERSTELLUNG DER PROVIRUSMUTANTEN. 33 B.1.3.4 HERSTELLUNG DER SYNTHETISCHEN HIV-1 GENE.34 B.1.4 ISOLIERUNG UND ANALYSE GENOMISCHER DNA AUS HIV-1 INFIZIERTEN LYMPHOZYTEN.36 B.2 PROTEINE, PEPTIDE UND ANTIKOERPER.36 B.2.1 EXPRESSION UND REINIGUNG VON PROTEINEN.36 B.2.2 SYNTHETISCHE PEPTIDE.37 B.2.3 IN V/TRO-SPALTUNG DURCH DIE HIV-1 PROTEASE.38 B.2.3.1 SPALTUNG VON GST-P6-FUSIONSPROTEINEN DURCH DIE HIV-1 PROTEASE.38 B.2.3.2 SPALTUNG VON PEPTIDEN DURCH DIE HIV-1 PROTEASE.38 B.2.3.3 SPALTUNG VON GAG-VORLAEUFERN AUS VIRUSPARTIKELN DURCH DIE HIV-1 PROTEASE.39 BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN HTTP://D-NB.INFO/969111363 INHALTSVERZEICHNIS ' YY B.2.4 KONTINUIERLICHER CHROMOGENER PROTEASE-AKTIVITAETSTEST.39 B.2.5 ANTIKOERPER.39 B.2.5.1 HERSTELLUNG DES KANINCHENANTISERUMS A-GST-P7.39 B. 2.5.2 ANTIKOERPER FUER WESTERN BLOT-ANALYSEN.40 B.3 ZELLKULTURTECHNIKEN UND INFEKTIONEN.41 B.3.1 VERWENDETE ZELLLINIEN.41 B.3.2 TRANSIENTE TRANSFEKTION EUKARYONTISCHER ZELLEN.41 B.3.3 INFEKTION DER INDIKATORZELLLINIE HELA-CD4-LTR-SSGAL (MAGI-ASSAY).42 B.3.4 HERSTELLUNG UND TITRATION VON HIV-1 VIRUSSTOCKS.42 B.3.5 LANGZEITKULTUR VON HIV-1 INFIZIERTEN LYMPHOZYTEN.43 B. 4 ANALYSE DER TRANSIENTEN PROTEINEXPRESSION.43 B.4.1 QUANTIFIZIERUNG DES HIV-1 CAPSIDANTIGENS (P24-ELISA).43 B.4.2 YYFRAMESHIFT"-LUCIFERASEREPORTER ASSAY.44 B.4.3 ANALYSE DER TRANSIENTEN PROTEINEXPRESSION IM WESTERN BLOT.44 B. 4.4 FLUORESZENZMIKROSKOPIE.45 C ERGEBNISSE.46 C. 1 GESAMTKONZEPT ZUR FUNKTIONELLEN UNTERSUCHUNG DER PROTEASESPALTSTELLEN VON P6* IN VITRO UND IM KONTEXT DER VIRALEN REPLIKATION.46 C. 1.1 AUSGANGSUEBERLEGUNGEN.46 C.1.2 MUTAGENESE DER PROTEASESPALTSTELLEN VON P6* IM PROVIRALEN KONTEXT. 47 C. 1.2.1 MODIFIKATION DER N-TERMINALEN SPALTSTELLE.47 C.1.2.2 MODIFIKATION DER INTERNEN SPALTSTELLE.48 C.1.2.3 MODIFIKATION DER C-TERMINALEN SPALTSTELLE.49 C.1.3 ERGAENZENDE IN V/TRO-TESTSYSTEME.50 C.2 IN V/TRO-CHARAKTERISIERUNG DER MODIFIZIERTEN PROTEASESPALTSTELLEN VON P6.51 C.2.1 SPALTUNG VON SYNTHETISCHEN OLIGOPEPTIDEN.51 C.2.2 SPALTUNG VON REKOMBINANTEN GST-P6-FUSIONSPROTEINEN.54 C.3 EINFLUSS VON MODIFIKATIONEN DER CIS-AKTIVEN ELEMENTE AUF DIE YYFRAMESHIFT"-EFFIZIENZ.56 C.3.1 HERSTELLUNG DER YYFRAMESHIFT"-REPORTERKONSTRUKTE.56 C.3.2 YYFRAMESHIFT"-LUCIFERASEREPORTER ASSAY.57 C.4 EINFLUSS DER MODIFIZIERTEN C-TERMINALEN P6-RESTE AUF DIE AKTIVITAET MATURER HIV-1 PROTEASE.58 C.4.1 HERSTELLUNG UND REINIGUNG REKOMBINANTER P6-PROTEINE.58 C.4.2 KONTINUIERLICHER CHROMOGENER PROTEASE-AKTIVITAETSTEST.61 C.5 EINFLUSS DER MODIFIZIERTEN PROTEASESPALTSTELLEN VON P6* AUF DIE VIRALE REPLIKATION.62 C.5.1 HERSTELLUNG DER REKOMBINANTEN PROVIREN.62 C.5.2 EINFLUSS DER MUTATIONEN AUF DIE EXPRESSION UND INTRAZELLULAERE PROZESSIERUNG VIRALER PROTEINE.63 C.5.3 EINFLUSS DER MUTATIONEN AUF DIE ZUSAMMENSETZUNG UND MATURATION FREIGESETZTER VIREN.64 C.5.3.1 REIFUNG DER VIRALEN GAG-PROTEINE.64 C.5.3.2 REIFUNG DER VIRALEN POL-PROTEINE.66 INHALTSVERZEICHNIS III C.5.4 EINFLUSS DER MUTATIONEN AUF DIE INFEKTIOSITAET DER VIREN.67 C.5.4.1 REPLIKATION DER P6-MUTANTEN IN HUMANEN T-LYMPHOZYTEN.67 C.5.4.2 INFEKTIOSITAET DER P6-MUTANTEN IM MAGI-ASSAY.68 C.5.5 ZUSAMMENFASSUNG.70 C. 6 HERSTELLUNG VON SYNTHETISCHEN HL-VIRALEN GENEN ZUR UNTERSUCHUNG DES EINFLUSSES VON P6* AUF DIE PROTEASE-AKTIVITAET IN ZELLKULTUR.72 C.6.1 GESAMTKONZEPT.72 C.6.2 HERSTELLUNG VON SYNTHETISCHEN GENEN ZUR REV-UNABHAENGIGEN EXPRESSION VON P6- UND PROTEASE-PROTEINEN IN SAEUGERZELLEN.72 C.6.2.1 AUSGANGSUEBERLEGUNGEN.72 C.6.2.2 HERSTELLUNG DER SYNTHETISCHEN HL-VIRALEN GENE.73 C.6.3 ETABLIERUNG EINES PROTEASE-AKTIVITAETSTESTS IN ZELLKULTUR.74 C.6.3.1 EXPRESSION DER PROTEASE-VARIANTEN IN ZELLKULTUR.74 C.6.3.2 QUANTIFIZIERUNG DER PROTEASE-VERMITTELTEN ZYTOTOXIZITAET DURCH KOTRANSFEKTION EINES REPORTERPLASMIDS.75 C.6.3.3 NACHWEIS DER PROTEASE-AKTIVITAET DURCH SPALTUNG EINES NATUERLICHEN SUBSTRATS.76 C.6.4 REV-UNABHAENGIGE EXPRESSION DER VPR-FUSIONSPROTEINE IN SAEUGERZELLEN.77 C.6.5 KOTRANSFEKTIONSANALYSEN.80 C.6.5.1 VERPACKUNG VON VPR-FUSIONSPROTEINEN IN VIRUSPARTIKEL.80 C.6.5.2 EINFLUSS DER SYNTHETISCHEN GENE AUF DIE EXPRESSION UND REIFUNG VIRALER PROTEINE.81 C. 6.6 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK.82 D DISKUSSION.83 D. 1 ENTWICKLUNG EINES GESAMTKONZEPTS ZUR FUNKTIONELLEN UNTERSUCHUNG DER PROTEASESPALTSTELLEN VON P6 IN VITRO UND IM KONTEXT DER VIRALEN REPLIKATION.83 D. L .1 ANSAETZE ZUR AUFKLAERUNG VON SPALTEREIGNISSEN IN GAG-POL.83 D.1.2 MUTAGENESE DER PR-SPALTSTELLEN VON P6* IM VIRALEN KONTEXT.84 D.2 IN V/FRO-CHARAKTERISIERUNG DER MODIFIZIERTEN PROTEASESPALTSTELLEN VON P6.85 D.2.1 DIE MUTATIONEN IN P6 FUEHREN ZU VERAENDERTEN HYDROLYSERATEN BEI DER SPALTUNG VON PEPTIDSUBSTRATEN.85 D.2.2 VERLAESSLICHKEIT VON ALGORITHMEN FUER DIE VORHERSAGE VON SPALTEREIGNISSEN.87 D.3 EINFLUSS VON MODIFIKATIONEN DER C/S-AKTIVEN ELEMENTE AUF DIE YYFRAMESHIFT"-EFFIZIENZ.88 D.3.1 BEDEUTUNG DER C/S-AKTIVEN ELEMENTE FUER DIE VIRALE REPLIKATION.88 D.3.2 DER LESERASTERSPRUNG IST IN ALLEN P6-MUTANTEN FUNKTIONELL.89 D.4 EINFLUSS DER MODIFIZIERTEN C-TERMINI VON P6 AUF DIE AKTIVITAET MATURER HIV-1 PROTEASE.91 D.4.1 DIE C-TERMINALEN M5- UND M6-MODIFIKATIONEN VON P6* WIRKEN SICH NICHT SIGNIFIKANT AUF DIE INHIBITION DER PROTEASE-AKTIVITAET AUS.91 D.4.2 VERGLEICH DER INHIBITIONSANALYSEN MIT FRUEHEREN ERGEBNISSEN.91 INHALTSVERZEICHNIS IV D.5 EINFLUSS DER MODIFIZIERTEN PROTEASESPALTSTELLEN VON P6* AUF DIE VIRALE REPLIKATION.92 D.5.1 DIE INTERNEN CSM2- UND CSM3-MUTATIONEN HABEN KEINE ERKENNBARE AUSWIRKUNG AUF DIE AUTOPROZESSIERUNG DER PROTEASE.93 D.5.2 DIE C-TERMINALEN CSM5- UND CSM6-MUTATIONEN HABEN KEINEN EINFLUSS AUF DIE INFEKTIOSITAET REKOMBINANTER VIREN IN ZELLKULTUR.94 D.5.3 DIE C-TERMINALEN CSM4 UND CSM7-MUTATIONEN BLOCKIEREN DIE FREISETZUNG DER PROTEASE UND FUEHREN ZUR PRODUKTION NICHT-INFEKTIOESER VIRUSPARTIKEL.95 D.5.4 DIE CSM1-MUTANTE WEIST EINEN PROZESSIERUNGSDEFEKT DES NUKLEOCAPSID-PROTEINS AUF UND REPLIZIERT VERZOEGERT IN HUMANEN LYMPHOZYTEN.96 D.6 REIHENFOLGE DER SPALTEREIGNISSE IN UND UM P6.99 D.7 HERSTELLUNG VON SYNTHETISCHEN HL-VIRALEN GENEN ZUR UNTERSUCHUNG DES EINFLUSSES VON P6 AUF DIE PROTEASE-AKTIVITAET IN ZELLKULTUR.100 D.7.1 EFFIZIENTE EXPRESSION HL-VIRALER PROTEINE AUF DER BASIS SYNTHETISCHER GENE. 101 D.7.2 ENTWICKLUNG VON TESTSYSTEMEN ZUM NACHWEIS VON AKTIVITAET UND ZYTOTOXIZITAET DER HIV-1 PROTEASE.102 D.7.3 DIE KOPPLUNG AN FUSIONSPARTNER ERMOEGLICHT DIE EXPRESSION VON P6* IN SAEUGERZELLEN.103 D.7.4 VERPACKUNG VON NEGATIV MODULIERENDEN VPR-FUSIONSPROTEINEN IN VIRUSPARTIKEL.104 D.7.5 DIE KOEXPRESSION DER SYNTHETISCHEN GENE FUEHRT ZUR VERMINDERTEN FREISETZUNG VON VIRUSPARTIKELN AUS TRANSFIZIERTEN ZELLEN.105 D.7.6 AUSBLICK: OPTIMIERUNG DER P6*-FUSIONSPROTEINE FUER EINE EFFIZIENTE NEGATIV-MODULATION DER HIV-1 PROTEASE.106 E LITERATURVERZEICHNIS.108 VEROEFFENTLICHUNGEN. 129 LEBENSLAUF.131 DANKSAGUNG. 132 F ANHANG. 133 F.1 OLIGONUKLEOTIDE. 133 F.2 SEQUENZEN SYNTHETISCHER GENE.137 F.3 SEQUENZEN EUKARYONTISCHER EXPRESSIONSPLASMIDE.139
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