Zwei Untereinheiten aus Proteinkomplexen: die Kristallstruktur der APC10-Untereinheit des humanen Anaphase-promoting Complex und die Kristallstruktur der Carboxytransferase-Untereinheit der Glutaconyl-CoA-Decarboxylase aus Acidaminococcus fermentans
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INHALTSVERZEICHNIS
1 ZUSAMMENFASSUNG 1
1.1 DIE KRISTALLSTRUKTUR DER APC10-UNTEREINHEIT DES HUMANEN APC 1
1.2 DIE KRISTALLSTRUKTUR DER CARBOXYTRANSFERASE-UNTEREINHEIT DER
GLUTACONYL-COA 2
DECARBOXYLASE AUS
ACIDAMINOCOCCUS FERMENTANS
2 EINFUEHRUNG 4
2.1 DER
ANAPHASE-PROMOTING COMPLEX 4
2.1.1 DER ZELLTEILUNGSZYKLUS 4
2.1.2 REGULATION DURCH UBIQUITIN-ABHAENGIGE PROTEOLYSE 5
2.1.3 DER ANAPHASE-PROMOTING COMPLEX 7
2.1.4 REGULATION VON AKTIVITAET UND SUBSTRATSPEZIFITAET DES APC 9
2.1.5 DIE 11 UNTEREINHEITEN DES HUMANEN APC 10
APC2 UND APC 11
11
DIE TETRATRICOPEPTIDE-REPEAT (TPR) UNTEREINHEITEN
12
APCJ, APC4, APC5, APC9 UND CDC26
12
APC10/DOC1
12
2.2 DIE GLUTACONYL-COENZYM A DECARBOXYLASE AUS
ACIDAMINOCOCCUS FERMENTANS
14
2.2.1 NA
+/H+-ANTIPORTER 14
2.2.2 ENERGIEGEWINNUNG DURCH DECARBOXYLIERUNG 14
2.2.3 DIE FERMENTATION VON GLUTAMAT ZU ACETAT 15
2.2.4 GLUTACONYL-COA DECARBOXYLASE AUS
ACIDAMINOCOCCUS FERMENTANS
18
2.2.5 DIE BIOTINABHAENGIGE DECARBOXYLIERUNG 19
2.3 ZIELSETZUNG DER ARBEIT 22
3 MATERIALIEN UND METHODEN 23
3.1 MATERIALIEN 23
3.1.1 BAKTERIENSTAEMME, PLASMIDE, OLIGONUCLEOTIDE, ENZYME, MEDIEN UND 23
ANTIBIOTIKA
BAKTERIENSTAEMME
23
PLASMIDE
23
OLIGONUCLEOTIDE
23
ENZYME
24
MEDIEN
24
ANTIBIOTIKA
24
3.1.2 SONSTIGE MATERIALIEN 24
3.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 25
3.2.1 STERILES ARBEITEN 25
3.2.2 ETHANOLPREZIPITATION VON DNA 25
3.2.3 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 25
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
3.2.4 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE VON DNA-FRAGMENTEN 26
3.2.5 ISOLIERUNG VON DNA AUS AGAROSE-GELEN 26
3.2.6 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA 26
3.2.7 VERDAU VON DNA DURCH RESTRIKTIONSENDONUCLEASEN 26
3.2.8 DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN 27
3.2.9 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN 27
3.2.10 TRANSFORMATION KOMPETENTER
E.COLI-ZEWEN 27
ELEKTROPORATION
27
TRANSFORMATION CHEMISCH KOMPETENTER ZELLEN
27
3.2.11 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA 28
3.2.12 DNA-SEQUENZIERUNG 28
3.3 MIKROBIOLOGISCHE METHODEN 28
3.3.1 BAKTERIENKULTUREN 28
FLUESSIGKULTUR VON BAKTERIEN
28
PLATTENKULTUR VON BAKTERIEN
28
3.3.2 HETEROLOGE EXPRESSION VON REKOMBINANTEM PROTEIN IN
E. COLI 29
3.3.2.1 EXPRESSION VON APC10 UND APCAC14 IN UNLOESLICHER FORM 29
3.3.2.2 EXPRESSION VON GCDA 29
3.3.2.3 EXPRESSION DES MIT SELENOMETHIONIN MARKIERTEN PROTEINS 30
3.3.3 AUFSCHLUSS VON
E.COLI ZELLEN 31
3.3.4 PRAEPARATION VON
INCLUSION BODIES 31
3.4 PROTEINCHEMISCHE METHODEN 32
3.4.1 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION 32
COLORIMETRISCHE PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD
32
BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION ANHAND DES
32
A BSORPTIONSKOEFFIZIENTEN
3.4.2 SDS-PAGE-GELELEKTROPHORESE 32
COOMASSIE-FAERBUNG
33
SILBERFAERBUNG NACH MARCINKA
33
3.4.3 WESTERN-BLOT UND DETEKTION DER PROTEINE AUF DER MEMBRAN
34
DETEKTION VON PROTEINEN IM WESTERN-BLOT MITTELS ANTIKOERPER-FAERBUNG 35
3.5 PRAEPARATION VON APC 10/DOC1
35
3.5.1 RUECKFALTUNG VON APC 10
35
3.5.2 REINIGUNG DES RENATURIERTEN APC 10 36
3.5.3 MASSENSPEKTROSKOPIE
37
3.5.4 PROTEINREINIGUNG VON APC 10AC14 37
3.5.5 PROTEINREINIGUNG DER GCDA-UNTEREINHEIT DER GLUTACONYL-COA- 38
DECARBOXYLASE
II
INHALTSVERZEICHNIS
3.6 KRISTALLOGRAPHIE UND STRUKTURBESTIMMUNG 39
3.6.1 KRISTALLISATION 40
3.6.2 THEORETISCHER HINTERGRUND 40
3.6.2.1 KRISTALLAUFBAU 40
3.6.2.2 BEUGUNG VON ROENTGENSTRAHLEN AN KRISTALLEN 41
3.6.2.3 DAS REZIPROKE GITTER 41
3.6.2.4 DIE EWALD-KONSTRUKTION 42
3.6.2.4 FRIEDEL'SCHES GESETZ 42
3.6.2.5 DIE ELEKTRONENDICHTEFUNKTION UND DIE PATTERSONFUNKTION 42
3.6.2.6 DAS PHASENPROBLEM 44
3.6.2.7 MULTIPLER ISOMORPHER ERSATZ 44
3.6.2.8 DIE ANOMALE STREUUNG 46
3.6.2.9 MULTIPLE ANOMALE DISPERSION (MAD) 47
3.6.3 DATENSAMMLUNG UND DATENAUSWERTUNG 48
3.6.4 MODELLBAU UND VERFEINERUNG 49
3.6.5 GEOMETRISCHE ANALYSEN DER STRUKTUREN SOWIE DER PROTEINOBERFLAECHE
50
3.6.6 SUCHE NACH SEQUENZ UND STRUKTURHOMOLOGIE 50
3.6.7 GRAPHISCHE DARSTELLUNGEN 50
4 ERGEBNISSE 51
4.1 DIE KRISTALLSTRUKTUR VON HUMANEM APC10 51
4.1.1 EXPRESSION UND REINIGUNG VON HUMANEM APC 10 SOWIE VON 51
APC10AC14
4.1.2 RENATURIERUNG VON APC 10 51
4.1.3 KRISTALLISATION VON APC 10AC14 53
4.1.4 BESTIMMUNG VON RAUMGRUPPE UND ZELLKONSTANTEN 55
4.1.5 MAD-EXPERIMENT UND BERECHNUNG DER INITIALEN ELEKTRONENDICHTE 56
4.1.6 MODELLBAU UND VERFEINERUNG 57
4.1.7 STRUKTURBESCHREIBUNG 58
4.1.8 STRUKTURELL HOMOLOGE PROTEINE 60
4.1.9 DER C-TERMINUS VON APC 10 62
4.2 DIE KRISTALLSTRUKTUR DER CARBOXYTRANSFERASE-UNTEREINHEIT (GCDA) DER
GLUTACONYL- 64
COA DECARBOXYLASE AUS ACIDAMINOCOCCUS FERMENTANS
4.2.1 PROTEINEXPRESSION UND REINIGUNG DER GCDA 64
4.2.2 MOLEKULARGEWICHTSBESTIMMUNG DER GCDA 65
4.2.3. KRISTALLISATION 66
4.2.4 MAD-EXPERIMENT, LOESUNG DES PHASENPROBLEMS UND MODELLBAU 67
4.2.5 STRUKTURBESCHREIBUNG 71
DOMAENE I
73
III
INHALTSVERZEICHNIS
DOMAENE II
74
4.2.6 DIE STRUKTURAEHNLICHKEIT ZWISCHEN DEN DOMAENEN I UND II 76
4.2.7 DIE OBERFLAECHE DER GCDA-STRUKTUR 77
4.2.8 STRUKTURVERWANDTE PROTEINE 78
4.2.9 IDENTIFIZIERUNG DER SUBSTRATBINDUNGSSTELLE IN DER GCDA-STRUKTUR 81
4.2.10 DIE ARCHITEKTUR DER SUBSTRATBINDUNGSTASCHE 83
4.2.11 DER BIOTIN-CARRIER DER GLUTACONYL-COENZYM A DECARBOXYLASE 85
4.2.12 DIE INTERAKTION MIT DEM BIOTIN-CARRIER 86
5 DISKUSSION GG
5.1. DIE APC10-UNTEREINHEIT DES HUMANEN APC 88
5.1.1 INVARIANTE AMINOSAEUREN IN DEN APC 10 UNTEREINHEITEN VERSCHIEDENER
88
SPEZIES
5.1.2 EINBLICKE IN EINE MOEGLICHE FUNKTION VON APC 10 INNERHALB DES HOLO-
89
APC
5.1.3 DIE STRUKTUR DES APC 10 AUS SACCHAROMYCES CEREVISIAE 90
5.1.4 DIE APC 10 STRUKTUR ALS LEITSTRUKTUR FUER ANDERE DOC-DOMAENEN
PROTEINE 91
5.2 DIE GCDA-UNTEREINHEIT DER GLUTACONYL-COA-DECARBOXYLASE 93
5.2.1 DAS MOLEKULARGEWICHT DER NATIVEN GCDA 93
5.2.2 DIE ENTWICKLUNG VON ZWEI SUBSTRATBINDUNGSSTELLEN MIT 94
UNTERSCHIEDLICHER SPEZIFITAET IN DER GCDA
5.2.3 DER GCDA/GLUTACONYL-COA-KOMPLEX : EINBLICKE IN DEN MECHANISMUS 95
DER CARBOXYTRANSFERASE
5.2.4 SEQUENZAEHNLICHE DECARBOXYLASEN 96
5.2.5 WEITERE ZIELE 98
6 LITERATURVERZEICHNIS 99
IV |
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Bibliotheksmagazin
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0001 DM 22563
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