Availability: Charakterisierung direkt reprogrammierter Nierentubuluszellen und Etablierung eines Krankheitsmodells

Charakterisierung direkt reprogrammierter Nierentubuluszellen und Etablierung eines Krankheitsmodells:

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Main Author:	Müller, Anna-Lena (Author)
Format:	Thesis/Dissertation Book
Language:	German
Published:	Freiburg im Breisgau [2020]
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adam_text	INHALT 1 EINLEITUNG .............................................................................................................. 1 1.1 AUFBAU UND FUNKTION DER NIERE ...................................................................... 1 1.2 CHRONISCHE NIERENINSUFFIZIENZ - DEFINITION UND AETIOLOGIE .............................. 2 1.3 POLYZYSTISCHE NIERENERKRANKUNG ................................................................... 2 1.3.1 KLASSIFIKATION UND AETIOLOGIE .................................................................... 2 1.4 AUTOSOMAL-DOMINANTE POLYZYSTISCHE NIERENERKRANKUNG ............................... 4 1.4.1 AETIOLOGIE .................................................................................................. 4 1.4.2 DAS POLYCYSTIN-1 PROTEIN ........................................................................ 4 1.4.3 PATHOGENESE DER ADPKD ....................................................................... 6 1.5 POLYZYSTISCHE NIERENERKRANKUNG IM KRANKHEITSMODELL............................... 10 1.6 REPROGRAMMIERUNG UND GEZIELTE DIFFERENZIERUNG IN VITRO ............................ 11 1.6.1 DIREKTE REPROGRAMMIERUNG................................................................... 13 2 FRAGESTELLUNG .................................... 15 3 MATERIAL UND METHODEN ....................................................................................... 16 3.1 MATERIAL ........................................................................................................ 16 3.1.1 GERAETE UND VERBRAUCHSMATERIALIEN ...................................................... 16 3.1.2 CHEMIKALIEN .......................................................................................... 18 3.1.3 ENZYME ................................................................................................. 19 3.1.4 KOMMERZIELL ERWERBLICHE KITS ............................................................... 20 3.1.5 ZELLKULTURMEDIA UND ZUSAETZE ................................................................ 20 3.1.6 ANTIKOERPER ............................................................................................ 21 3.1.7 PRIMER ................................................................................................... 22 3.1.8 ZELLLINIEN & BAKTERIENSTAEMME .............................................................. 24 3.2 METHODEN .................................................................................................... 24 3.2.1 KULTIVIERUNG VON ZELLLINIEN .................................................................... 24 3.2.2 VIRUSPRODUKTION .................................................................................... 25 3.2.3 LENTIVIRALE TRANSDUKTION ........................................................................ 26 3.2.4 DURCHFLUSSZYTOMETRIE UND ZELLSORTIERUNG .............................................. 26 3.2.5 KLONALE SELEKTION DER PKD1 -MEFS ...................................................... 27 3.2.6 RNA ISOLIERUNG...................................................................................... 27 3.2.7 REVERSE TRANSKRIPTION ........................................................................... 29 3.2.8 QUANTITATIVE REAL-TIME-PCR .................................................................. 29 3.2.9 IMMUNHISTOCHEMIE................................................................................ 31 3.2.10 POLYMERASE-KETTENREAKTION.................................................................... 33 3.2.11 KLONIERUNG............................................................................................. 34 3.2.12 WESTERN BLOT ......................................................................................... 41 3.2.13 DATENAUSWERTUNG................................................................................. 44 4 ERGEBNISSE .......................................................................................................... 46 4.1 DIREKTE REPROGRAMMIERUNG VON MURINEN EMBRYONALEN FIBROBLASTEN ZU INDUZIERTEN NIERENTUBULUSZELLEN............................................................................. 46 4.1.1 KSP-CRE REPORTERSYSTEM UND ABLAUF DER REPROGRAMMIERUNG ........... 46 4.1.2 EFFIZIENZ DER REPROGRAMMIERUNG .......................................................... 47 4.2 BEDEUTUNG DER EINZELNEN TRANSKRIPTIONSFAKTOREN........................................ 49 4.2.1 REPROGRAMMIERUNG MITTELS MARKIERTER TRANSKRIPTIONSFAKTOREN ............. 49 4.2.2 NACHWEIS DER TRANSKRIPTIONSFAKTOREN IM WESTERN BLOT ........................ 50 4.3 SEGMENTIDENTITAET .......................................................................................... 52 4.4 SENESZENZ .................................................................................................. 57 4.5 ANWENDUNG IM PKD1 - KRANKHEITSMODELL ................................................... 60 4.5.1 SELEKTION DER PKD1-KLONE ................................................................... 61 4.5.2 EXZISION DER EXONE 2-4 DES PKD1-GENS .............................................. 64 4.5.3 SPHAEROIDBILDUNG IN 3D-MATRIX............................................................... 68 5 DISKUSSION........................................................................................................... 72 5.1 DIREKTE REPROGRAMMIERUNG VON FIBROBLASTEN ZU INDUZIERTEN NIERENTUBULUSZELLEN................................................................................................ 72 5.1.1 EINSATZ DER MARKIERTEN TRANSKRIPTIONSFAKTOREN ZUR EFFIZIENZSTEIGERUNG DER REPROGRAMMIERUNG ...................................................................................... 72 5.1.2 IRECS SIND EINE STABILE ZELLLINIE UND LASSEN SICH IN ZELLKULTUR RASCH EXPANDIEREN ....................................................................................................... 75 5.1.3 IRECS SIND EINE HETEROGENE ZELLPOPULATION OHNE SEGMENTSPEZIFITAET... 76 5.1.4 ETABLIERUNG EINER NEUEN METHODE ZUR SELEKTION ................................. 77 5.2 PKD1 KRANKHEITSMODELL: ERFORSCHUNG DER PATHOGENESE UND THERAPIE ...... 77 5.2.1 BISHERIGE ERFOLGE IM PKD1 KRANKHEITSMODELL ...................................... 77 5.3 KRITIK AN DER METHODIK: ................................................................................. 80 5.4 EINORDNUNG DER ERGEBNISSE UND AUSBLICK: .................................................... 80 6 ZUSAMMENFASSUNG.............................................................................................. 83 7 LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................................. 84 8 PUBLIKATION .......................................................................................................... 95 9 ANHANG ................................................................................................................ 96 9.1 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS ............................................................................... 96 9.2 ABBILDUNGSVERZEICHNIS ................................................................................ 98 9.3 LEBENSLAUF ................................................................................................. 100 9.4 EIDESSTATTLICHE VERSICHERUNG ...................................................................... 102 9.5 ERKLAERUNG ZUM EIGENANTEIL ......................................................................... 103 DANKSAGUNG ............................................................................................................. 105
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