Charakterisierung direkt reprogrammierter Nierentubuluszellen und Etablierung eines Krankheitsmodells:
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Freiburg im Breisgau
[2020]
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1
EINLEITUNG
..............................................................................................................
1
1.1
AUFBAU
UND
FUNKTION
DER
NIERE
......................................................................
1
1.2
CHRONISCHE
NIERENINSUFFIZIENZ
-
DEFINITION
UND
AETIOLOGIE
..............................
2
1.3
POLYZYSTISCHE
NIERENERKRANKUNG
...................................................................
2
1.3.1
KLASSIFIKATION
UND
AETIOLOGIE
....................................................................
2
1.4
AUTOSOMAL-DOMINANTE
POLYZYSTISCHE
NIERENERKRANKUNG
...............................
4
1.4.1
AETIOLOGIE
..................................................................................................
4
1.4.2
DAS
POLYCYSTIN-1
PROTEIN
........................................................................
4
1.4.3
PATHOGENESE
DER
ADPKD
.......................................................................
6
1.5
POLYZYSTISCHE
NIERENERKRANKUNG
IM
KRANKHEITSMODELL...............................
10
1.6
REPROGRAMMIERUNG
UND
GEZIELTE
DIFFERENZIERUNG
IN
VITRO
............................
11
1.6.1
DIREKTE
REPROGRAMMIERUNG...................................................................
13
2
FRAGESTELLUNG
....................................
15
3
MATERIAL
UND
METHODEN
.......................................................................................
16
3.1
MATERIAL
........................................................................................................
16
3.1.1
GERAETE
UND
VERBRAUCHSMATERIALIEN
......................................................
16
3.1.2
CHEMIKALIEN
..........................................................................................
18
3.1.3
ENZYME
.................................................................................................
19
3.1.4
KOMMERZIELL
ERWERBLICHE
KITS
...............................................................
20
3.1.5
ZELLKULTURMEDIA
UND
ZUSAETZE
................................................................
20
3.1.6
ANTIKOERPER
............................................................................................
21
3.1.7
PRIMER
...................................................................................................
22
3.1.8
ZELLLINIEN
&
BAKTERIENSTAEMME
..............................................................
24
3.2
METHODEN
....................................................................................................
24
3.2.1
KULTIVIERUNG
VON
ZELLLINIEN
....................................................................
24
3.2.2
VIRUSPRODUKTION
....................................................................................
25
3.2.3
LENTIVIRALE
TRANSDUKTION
........................................................................
26
3.2.4
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
UND
ZELLSORTIERUNG
..............................................
26
3.2.5
KLONALE
SELEKTION
DER
PKD1
-MEFS
......................................................
27
3.2.6
RNA
ISOLIERUNG......................................................................................
27
3.2.7
REVERSE
TRANSKRIPTION
...........................................................................
29
3.2.8
QUANTITATIVE
REAL-TIME-PCR
..................................................................
29
3.2.9
IMMUNHISTOCHEMIE................................................................................
31
3.2.10
POLYMERASE-KETTENREAKTION....................................................................
33
3.2.11
KLONIERUNG.............................................................................................
34
3.2.12
WESTERN
BLOT
.........................................................................................
41
3.2.13
DATENAUSWERTUNG.................................................................................
44
4
ERGEBNISSE
..........................................................................................................
46
4.1
DIREKTE
REPROGRAMMIERUNG
VON
MURINEN
EMBRYONALEN
FIBROBLASTEN
ZU
INDUZIERTEN
NIERENTUBULUSZELLEN.............................................................................
46
4.1.1
KSP-CRE
REPORTERSYSTEM
UND
ABLAUF
DER
REPROGRAMMIERUNG
...........
46
4.1.2
EFFIZIENZ
DER
REPROGRAMMIERUNG
..........................................................
47
4.2
BEDEUTUNG
DER
EINZELNEN
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN........................................
49
4.2.1
REPROGRAMMIERUNG
MITTELS
MARKIERTER
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
.............
49
4.2.2
NACHWEIS
DER
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
IM
WESTERN
BLOT
........................
50
4.3
SEGMENTIDENTITAET
..........................................................................................
52
4.4
SENESZENZ
..................................................................................................
57
4.5
ANWENDUNG
IM
PKD1
-
KRANKHEITSMODELL
...................................................
60
4.5.1
SELEKTION
DER
PKD1-KLONE
...................................................................
61
4.5.2
EXZISION
DER
EXONE
2-4
DES
PKD1-GENS
..............................................
64
4.5.3
SPHAEROIDBILDUNG
IN
3D-MATRIX...............................................................
68
5
DISKUSSION...........................................................................................................
72
5.1
DIREKTE
REPROGRAMMIERUNG
VON
FIBROBLASTEN
ZU
INDUZIERTEN
NIERENTUBULUSZELLEN................................................................................................
72
5.1.1
EINSATZ
DER
MARKIERTEN
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
ZUR
EFFIZIENZSTEIGERUNG
DER
REPROGRAMMIERUNG
......................................................................................
72
5.1.2
IRECS
SIND
EINE
STABILE
ZELLLINIE
UND
LASSEN
SICH
IN
ZELLKULTUR
RASCH
EXPANDIEREN
.......................................................................................................
75
5.1.3
IRECS
SIND
EINE
HETEROGENE
ZELLPOPULATION
OHNE
SEGMENTSPEZIFITAET...
76
5.1.4
ETABLIERUNG
EINER
NEUEN
METHODE
ZUR
SELEKTION
.................................
77
5.2
PKD1
KRANKHEITSMODELL:
ERFORSCHUNG
DER
PATHOGENESE
UND
THERAPIE
......
77
5.2.1
BISHERIGE
ERFOLGE
IM
PKD1
KRANKHEITSMODELL
......................................
77
5.3
KRITIK
AN
DER
METHODIK:
.................................................................................
80
5.4
EINORDNUNG
DER
ERGEBNISSE
UND
AUSBLICK:
....................................................
80
6
ZUSAMMENFASSUNG..............................................................................................
83
7
LITERATURVERZEICHNIS
.............................................................................................
84
8
PUBLIKATION
..........................................................................................................
95
9
ANHANG
................................................................................................................
96
9.1
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
...............................................................................
96
9.2
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
................................................................................
98
9.3
LEBENSLAUF
.................................................................................................
100
9.4
EIDESSTATTLICHE
VERSICHERUNG
......................................................................
102
9.5
ERKLAERUNG
ZUM
EIGENANTEIL
.........................................................................
103
DANKSAGUNG
.............................................................................................................
105
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