Availability: Untersuchungen zur Autophagieinduktion in Leishmania major-infizierten Knochenmarksmakrophagen

Untersuchungen zur Autophagieinduktion in Leishmania major-infizierten Knochenmarksmakrophagen: = Analyses of autophagy induction in Leishmania major-infected bone marrow-derived macrophages

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Main Author:	Frank, Benjamin 1988- (Author)
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Published:	Würzburg September 2015
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adam_text	AUS DEM INSTITUT FUER MOLEKULARE INFEKTIONSBIOLOGIE DER UNIVERSITAET WUERZBURG VORSTAND: PROF. DR. JOERG VOGEL UNTERSUCHUNGEN ZUR AUTOPHAGIEINDUKTION IN LEISHMANIA WA/OR-INFIZIERTEN KNOCHENMARKSMAKROPHAGEN INAUGURAL - DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DER DOKTORWUERDE DER MEDIZINISCHEN FAKULTAET DER JULIUS-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET WUERZBURG VORGELEGT VON BENJAMIN FRANK AUS STIMPFACH WUERZBURG, SEPTEMBER 2015 INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG........................................................................................................................1 1.1 LEISHMANIOSE.............................................................................................................1 1.1.1 ALLGEMEINES........................................................................................................1 1.1.2 LEBENSZYKLUS DER LEISHMANIEN ......................................................................... 1 1.1.3 FORMEN DER LEISHMANIOSE................................................................................. 4 1.1.4 DERZEITIGE BEHANDLUNG DER LEISHMANIOSE.........................................................6 1.2 AUTOPHAGIE............................................................................................................... 7 1.2.1 ALLGEMEINES ZUR AUTOPHAGIE.............................................................................7 1.2.2 AUTOPHAGIE IN INFEKTIONSKRANKHEITEN................................................................9 1.3 ZIELSETZUNG DER VORLIEGENDEN ARBEIT ...................................................................... 11 2 MATERIAL UND METHODEN................................................................................................ 13 2.1 MATERIALIEN UND GERAETE .......................................................................................... 13 2.1.1 ALLGEMEINE CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN ...................................................... 13 2.1.2 VERBRAUCHSMATERIALIEN UND KITS ...................................................................... 14 2.1.3 GERAETE...............................................................................................................15 2.1.4 ANTIKOERPER UND SIRNAS ................................................................................... 16 2.1.5 MEDIEN UND PUFFER........................................................................................... 17 2.1.6 VERWENDETE LEISHMANIEN-STAEMME, ZELLLINIEN UND VERSUCHSTIERE ................... 19 2.1.7 SOFTWARE.......................................................................................................... 20 2.2 METHODEN............................................................................................................... 20 2.2.1 ZELLKULTURMETHODEN.........................................................................................20 2.2.1.1 KULTIVIERUNG VON L. M. PROMASTIGOTEN.....................................................20 2.2.1.2 ERNTE UND BESTIMMUNG DER ZELLZAHL VON L M. PROMASTIGOTEN .................. 21 2.2.1.3 KULTIVIERUNG UND GEWINNUNG DES UEBERSTANDS VON L929-ZELLEN...............21 2.2.1.4 GENERIERUNG VON BMDM AUS S Z .............................................................22 2.2.1.5 INFEKTION VON BMDM MIT L. M. PROMASTIGOTEN.......................................23 2.2.1.6 AUTOPHAGIEINDUKTION IN NICHT-INFIZIERTEN BMDM....................................24 2.2.2 LICHTMIKROSKOPIE............................................................................................ 24 2.2.2.1 BESTIMMUNG DER INFEKTIONSRATE IN L. M.-INFIZIERTEN BMDM ................... 24 2.2.2.2 BESTIMMUNG DES NUKLEUS-KINETOPLAST-ABSTANDS IN L. M.-INFIZIERTEN BMDM................................................................................................................. 25 2.2.3 TEM ................................................................................................................ 25 2.2.3.1 EINBETTUNG DER PROBEN FUER TEM............................................................25 2.23.2 ERSTELLUNG EINES SEMIQUANTITATIVEN SCORES ZUR AUTOPHAGIEMESSUNG ... 27 2.2.3.3 ELEKTRONENTOMOGRAFIE ........................................................................... 28 2.2.4 TRANSKRIPTOMANALYSEN.....................................................................................28 2.2.4.1 ISOLATION VON RNA AUS L. M.-INFIZIERTEN BMDM ................................... 28 2.2.4.2 HYBRIDISIERUNG VON AFFYMETRIX MICROARRAYS...........................................29 2.2.4.3 BIOINFORMATISCHE AUFBEREITUNG DER MICROARRAY-DATEN ........................... 30 2.2.5 WESTERN-BLOT-ANALYSEN................................................................................... 30 2.2.5.1 GEWINNUNG VON PROTEINLYSATEN.................................................................30 2.2.5.2 HERSTELLUNG DER SDS-PAGE-GELE............................................................31 2.2.5.3 AUFBAU UND DURCHFUEHRUNG DER WESTERN BLOTS..........................................32 2.2.6 HERUNTERREGULATION DER GENEXPRESSION MIT SIRNA.........................................33 2.2.7 STATISTISCHE METHODEN.....................................................................................34 3 ERGEBNISSE..................................................................................................................... 36 3.1 AUTOPHAGIEINDUKTION IN L. M.-INFIZIERTEN BMDM.................................................36 3.1.1 TEM UNTERSUCHUNGEN ZUR AUTOPHAGIEINDUKTION............................................36 3.1.2 UNTERSUCHUNG DER AUTOPHAGIEINDUKTION MIT LC3B WESTERN-BLOT-ANALYSEN 39 3.2 VERDAU VON L. M. PARASITEN IN BMDM ................................................................ 43 3.3 UNTERSUCHUNG WEITERER AUTOPHAGIERELEVANTER PROTEINE ......................................... 44 3.3.1 UNTERSUCHUNGEN DER EXPRESSION VON ATG5....................................................45 3.3.2 UNTERSUCHUNGEN DER EXPRESSION VON U B ....................................................... 47 3.4 ROLLE VON MLS IM VERDAU VON L. M. PARASITEN ................................................... 47 3.5 IDENTIFIKATION INFEKTIONSSPEZIFISCHER GENE............................................................50 3.5.1 ERSTELLUNG EINES NETZWERKS AUS AUTOPHAGIERELEVANTEN GENEN ....................... 50 3.5.2 IDENTIFIKATION WEITERER INFEKTIONSSPEZIFISCHER AUTOPHAGIEGENE ..................... 53 3.6 UNTERSUCHUNG VON BNIP3 UND CTSE ALS AUTOPHAGIERELEVANTE PROTEINE ............. 54 3.6.1 UNTERSUCHUNGEN DER EXPRESSION VON BNIP3...................................................54 3.6.2 UNTERSUCHUNGEN DER EXPRESSION VON CTSE....................................................58 3.7 ENTWICKLUNG DES TOTALEN AUTOPHAGIESCORES WAEHREND DER L. M. INFEKTION ...... . 59 4 DISKUSSION.................................................................................................................... 61 5 ZUSAMMENFASSUNG........................................................................................................ 68 6 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS................................................................................................ 70 7 LITERATURVERZEICHNIS...................................................................................................... 74 8 ABBILDUNGS- UND TABELLENVERZEICHNIS..........................................................................79 9 ANHANG......................................................................................................................... 80
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