Charakterisierung biochemischer Eigenschaften des P2Y1-Rezeptors in heterologen Expressionssystemen und dessen Gewebeexpression in einer BAC-transgenen TagRFP-P2Y1-Reportermaus:
Saved in:
| Main Author: | |
|---|---|
| Format: | Thesis/Dissertation Book |
| Language: | German |
| Published: |
2015
|
| Subjects: | |
| Links: | http://d-nb.info/1076593623/04 http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=028427825&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA |
| Physical Description: | 166 S. Ill., graph. Darst. 21 cm |
Staff View
MARC
| LEADER | 00000nam a2200000 c 4500 | ||
|---|---|---|---|
| 001 | BV043002630 | ||
| 003 | DE-604 | ||
| 005 | 00000000000000.0 | ||
| 007 | t| | ||
| 008 | 151112s2015 gw ad|| m||| 00||| ger d | ||
| 015 | |a 15,H11 |2 dnb | ||
| 016 | 7 | |a 1076593623 |2 DE-101 | |
| 035 | |a (OCoLC)929989224 | ||
| 035 | |a (DE-599)DNB1076593623 | ||
| 040 | |a DE-604 |b ger | ||
| 041 | 0 | |a ger | |
| 044 | |a gw |c XA-DE | ||
| 049 | |a DE-355 |a DE-83 | ||
| 082 | 0 | |a 573.84819353 |2 22/ger | |
| 084 | |a 570 |2 sdnb | ||
| 100 | 1 | |a Schumacher, Michaela |d 1986- |e Verfasser |0 (DE-588)1075087538 |4 aut | |
| 245 | 1 | 0 | |a Charakterisierung biochemischer Eigenschaften des P2Y1-Rezeptors in heterologen Expressionssystemen und dessen Gewebeexpression in einer BAC-transgenen TagRFP-P2Y1-Reportermaus |c vorgelegt von Michaela Schumacher |
| 264 | 1 | |c 2015 | |
| 300 | |a 166 S. |b Ill., graph. Darst. |c 21 cm | ||
| 336 | |b txt |2 rdacontent | ||
| 337 | |b n |2 rdamedia | ||
| 338 | |b nc |2 rdacarrier | ||
| 502 | |a Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2015 | ||
| 655 | 7 | |0 (DE-588)4113937-9 |a Hochschulschrift |2 gnd-content | |
| 856 | 4 | 2 | |m B:DE-101 |q application/pdf |u http://d-nb.info/1076593623/04 |3 Inhaltsverzeichnis |
| 856 | 4 | 2 | |m DNB Datenaustausch |q application/pdf |u http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=028427825&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA |3 Inhaltsverzeichnis |
| 943 | 1 | |a oai:aleph.bib-bvb.de:BVB01-028427825 | |
Record in the Search Index
| _version_ | 1819332776786132992 |
|---|---|
| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 DIE MAUS ALS MODELLORGANISMUS 10
1.2 TRANSGENE MAEUSE 10
1.3 FLUORESZENZPROTEINE 13
1.4 PURINERGE REZEPTOREN 16
1.4.1 P2Y-REZEPTOREN 16
1.4.1.1 P2Y1-REZEPTOREN 19
1.4.1.2 P2Y2-REZEPTOREN 20
1.4.1.3 P2Y12-REZEPTOREN 20
1.4.2 OLIGOMERISIERUNG UND PHYSIOLOGISCHE INTERAKTIONEN DER
P2Y-REZEPTOREN 20
1.4.3 P2Y-KNOCKOUTMAEUSE 22
1.4.4 DIE ROLLE DER P2Y-REZEPTOREN BEI DER THROMBOZYTENAGGREGATION 23
1.4.5 MOLEKULARE EIGENSCHAFTEN DER P2Y-REZEPTOREN 24
1.4.6 N-GLYKOSYLIERUNG DER P2Y-REZEPTOREN 28
1.4.7 BIOSYNTHESE VON MEMBRANPROTEINEN 28
1.4.8 ABLAUF DER N-GLYKOSYLIERUNGSREAKTION 31
1.4.9 ZIELSETZUNG 33
2 MATERIAL UND METHODEN 34
2.1 MATERIAL 34
2.1.1 CHEMIKALIEN 34
2.1.2 OLIGONUKLEOTIDE 34
2.1.3 ENZYME 34
2.1.4 DETERGENZIEN 34
2.1.5 WASSER 34
2.1.6 KOMMERZIELL ERHAELTLICHE KITS ZUR DNA-AUFREINIGUNG 35
2.1.7 VERWENDETE PLASMIDE UND VEKTOREN 35
2.1.8 VERWENDETE ANTIKOERPER 36
5
HTTP://D-NB.INFO/1076593623
INHALTSVERZEICHNIS
2.1.9 VERWENDETE TIERE UND BAKTERIENSTAEMME 36
2.1.9.1 ESCHERICHIA COLI (K12) DH5FF-ZELLEN 36
2.1.9.2 ESCHERICHIA COLI (K12) XL1-BLUE-ZELLEN 36
2.1.9.3 HEK293-ZELLEN 36
2.1.9.4 MUS MUSCULUS (MAEUSE DES STAMMES C57/BL6J) 37
2.1.9.5 XENOPUS LAEVIS (SUEDAFRIKANISCHER KRALLENFROSCH) 37
2.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 38
2.2.1 TRANSFORMATION UND ISOLIERUNG VON PLASMIDEN AUS E.COLI 38
2.2.2 MODIFIKATION VON PLASMID-DNA DURCH QUIKCHANGE-MUTAGENESE 38
2.2.3 GATEWAY-KLONIERUNG 38
2.2.4 MEGAPRIMER-MUTAGENESE 39
2.2.5 DNA-SEQUENZIERUNG 39
2.2.6 UEBERSICHT UEBER DIE HERGESTELLTEN CDNA-KONSTRUKTE 40
2.2.7 CRNA-SYNTHESE 40
2.3 EXPRESSION REKOMBINANTER PROTEINE IN HEK293-ZELLEN 41
2.3.1 KULTIVIERUNG ALS MONOLAYERKULTUR 41
2.3.2 REKULTIVIERUNG EINGEFRORENER ZELLEN 41
2.3.3 INDUKTION DER PROTEINEXPRESSION DER HEK293-ZELLEN 41
2.4 XENOPUS /AEWS-OOZYTEN ALS EXPRESSIONSSYSTEM 42
2.4.1 HERKUNFT UND HALTUNG DER FROESCHE 42
2.4.2 ENTNAHME DES OVARS 42
2.4.3 KOLLAGENASE-BEHANDLUNG DER XENOPUS LAEVIS-OOZYTEN 43
2.4.4 CRNA-INJEKTION IN X./AEWS-OOZYTEN 43
2.5 PROTEINCHEMISCHE METHODEN 44
2.5.1 METABOLISCHE MARKIERUNG MITTELS L-[
35
S]-METHIONIN 44
2.5.2 ISOLIERUNG REKOMBINANTER PROTEINE DURCH NICKEL-CHELAT
-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE . 44
2.5.3 STREP-TACTIN-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 46
2.5.4 FLUORESZENZMARKIERUNG VON OBERFLAECHENPROTEINEN MITTELS CY5- BZW.
IR800-MONO-
NHS-ESTER 46
2.5.5 ENZYMATISCHE DEGLYKOSYLIERUNG 47
2.5.6 POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 47
2.5.6.1 REDUZIERENDE UND NICHT REDUZIERENDE DENATURIERENDE SDS-PAGE ....
47
2.5.6.2 BLAUE-NATIVE-PAGE 49
6
INHALTSVERZEICHNIS
2.5.7 DETEKTION DER PROTEINE 51
2.5.7.1 TYPHOON-FLUORESZENZ IMAGING UND ODYSSEY-FLUORESZENZLMAGING 51
2.5.7.2 PHOSPHORLMAGING 52
2.6 CHARAKTERISIERUNG TRANSGENER REPORTERMAEUSE 53
2.6.1 HALTUNG DER MAEUSE 53
2.6.2 GENOTYPISIERUNG TRANSGENER MAEUSE MITTELS MULTIPLEX PCR 53
2.6.3 FIXIERUNG DES MAUSGEWEBES DURCH PERFUSION MIT PARAFORMALDEHYD 54
2.6.3.1 NARKOSE 54
2.6.3.2 PERFUSION 54
2.6.3.3 ENTNAHME DER ORGANE UND NACHFIXIERUNG 54
2.6.4 HERSTELLUNG UND LAGERUNG VON SCHNITTPRAEPARATEN 54
2.6.5 IMMUNHISTOCHEMISCHE ANALYSE VON GEWEBESCHNITTEN 55
2.6.6 PROTEINEXTRAKTION AUS MAUSGEWEBE 55
2.6.7 ISOLIERUNG VON MURINEM KNOCHENMARK 56
2.6.8 ISOLIERUNG MURINER THROMBOZYTEN 56
2.6.9 KONFOKALE LASER-SCANNING-MIKROSKOPIE 56 .
2.6.10 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE ANALYSEN DER REPORTERMAEUSE 57
3 ERGEBNISSE 59
3.1 CHARAKTERISIERUNG DER BAC-TRANSGENEN MAEUSE MIT
TAGRFP-P2Y1-REPORTERKONSTRUKT ... 59
3.1.1 IDENTIFIZIERUNG DER FOUNDERTIERE MITTELS GENOTYPISIERUNGS-PCR 60
3.1.2 VERGLEICH DER NATIVEN TAGRFP-EXPRESSION IM HIPPOCAMPUS DER
VERSCHIEDENEN FOUNDER-
MAUSLINIEN 60
3.1.3 LOKALISATION DER TAGRFP-EXPRESSION IN DER GESAMTEN
HIPPOCAMPUSFORMATION ... 62
3.1.4 IMMUNHISTOCHEMISCHE DARSTELLUNG DER P2RY1 -GENEXPRESSION DURCH
ANTI TAGRFP-
FAERBUNGEN 63
3.1.4.1 TAGRFP-EXPRESSION IM GEHIRN DER TAGRFP-P2Y1-REPORTERMAEUSE ....
63
3.1.4.2 TAGRFP-EXPRESSION IM RUECKENMARK DER TAGRFP-P2Y1-REPORTERMAEUSE .
68
3.1.4.3 TAGRFP-EXPRESSION IN ORGANEN AUSSERHALB DES ZNS DER TAGRFP-P2Y1-
REPORTERMAEUSE 71
3.1.5 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE ANALYSEN DER TAGRFP-P2Y1-REPORTERMAEUSE 74
3.1.5.1 ANALYSE DER THROMBOZYTEN MITTELS DURCHFLUSSZYTOMETRIE 74
3.1.5.2 ANALYSE DES KNOCHENMARKS MITTELS DURCHFLUSSZYTOMETRIE 77
3.1.6 ORGANSCREENING DER TAGRFP-P2Y1-REPORTERMAEUSE MITTELS
SDS-PAGE-ANALYSE . . 79
7
INHALTSVERZEICHNIS
3.2 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER REZEPTOREN P2Y1, P2Y2 UND P2Y12
81
3.2.1 SDS-PAGE-ANALYSE DER IN X. LAEVIS-OOZYTEN EXPRIMIERTEN
WILDTYP-VARIANTEN DER
REZEPTOREN P2Y1, P2Y2 UND P2Y12 81
3.2.2 UNTERSUCHUNG DES P2Y1-REZEPTORS AUF EINEN VERKUERZTEN OFFENEN
LESERAHMEN ODER
EINE PROTEOLYTISCHE SCHNITTSTELLE 85
3.2.3 EINFLUSS VERSCHIEDENER DETERGENZIEN AUF DIE MOBILERE PROTEINBANDE
DES MP2Y1-
REZEPTORS 86
3.2.4 UNTERSUCHUNG DES N-GLYKOSYLIERUNGSSTATUS DER REZEPTOREN P2Y1,
P2Y2, P2Y12 IN
X. /AEW S-OOZYTEN UND HEK-ZELLEN 89
3.2.5 UNTERSUCHUNG DER MP2Y1-UNTEREINHEIT AUF O-GLYKOSYLIERUNGSSTELLEN
90
3.2.6 PARTIELLE DEGLYKOSYLIERUNG DER UNTEREINHEITEN P2Y1, P2Y2 UND P2Y12
91
3.2.7 NATIVE DEGLYKOSYLIERUNG DER MP2Y1-UNTEREINHEIT 93
3.2.8 IDENTIFIZIERUNG DER N-GLYKOSYLIERUNGSSTELLEN AUF DER MP2Y1
-UNTEREINHEIT 94
3.2.9 UNTERSUCHUNG DES OLIGOMERISIERUNGSZUSTANDES DER REZEPTOREN P2Y1,
P2Y2, P2Y12 97
3.3 BIOCHEMISCHE INTERAKTIONEN ZWISCHEN P2Y- UND P2X-REZEPTOREN 99
4 DISKUSSION 114
4.1 AUSWAHL EINER TRANSGENEN MAUSLINIE 114
4.2 DAS TAGRFP-P2Y1-BAC HAT MOEGLICHERWEISE IN ZWEI UNTERSCHIEDLICHEN
LOCI IN DAS MAUS
GENOM INTEGRIERT 114
4.3 IMMUNHISTOCHEMISCHE LOKALISIERUNG DESTAGRFP-FLUORESZENZPROTEINS IN
DERTAGRFP-P2Y1-
REPORTERMAUS 115
4.4 AUSBLICK 120
4.5 DIE UNTERHEITEN P2Y1, P2Y2 UND P2Y12 LIEGEN IN N-GLYKOSYLIERTER FORM
IN DER PLASMA
MEMBRAN VOR 123
4.6 IM GEGENSATZ ZUM P2Y2- UND P2Y12-REZEPTOR ZEIGTE DER P2Y1- REZEPTOR
EINE PARTIELLE
RESISTENZ GEGEN DIE DEGLYKOSYLIERUNG MIT PNGASE F 124
4.7 DURCH PARTIELLE DEGLYKOSYLIERUNG KONNTE DER N-GLYKOSYLIERUNGSSTATUS
DES P2Y2- UND P2Y12-
REZEPTORS, NICHT ABER DES P2Y1 -REZEPTORS ERMITTELT WERDEN 125
4.8 DIE P2Y1-UNTERHEIT BESITZT VERMUTLICH VIER N-GLYKANE
UNTERSCHIEDLICHER GROESSE 126
4.9 DER P2Y1 -REZEPTOR BESITZT KEIN ABSPALTBARES SIGNALPEPTID UND
ERFAEHRT AUCH KEINE N-TERMINALE
TRUNKIERUNG DURCH PROTEOLYSE ODER EINEN VERKUERZTEN OFFENEN LESERAHMEN
127
4.10 DIE REZEPTOREN P2Y1, P2Y2 UND P2Y12 OLIGOMERISIEREN SOWOHL IN
X.LAEVIS-OOZYTEN ALS
AUCH IN HEK-ZELLEN 130
8
INHALTSVERZEICHNIS
4.11 DIE REZEPTOREN P2Y1, P2Y2 UND P2Y12 ZEIGEN EINE BIOCHEMISCHE
INTERAKTION MIT VERSCHIE
DENEN P2X-REZEPTOREN 131
5 ZUSAMMENFASSUNG 134
6 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 136
7 KLONIERTE CDNA-KONSTRUKTE 153
7.1 PUBLIKATIONEN 160
7.2 LEBENSLAUF 162
9
|
| any_adam_object | 1 |
| author | Schumacher, Michaela 1986- |
| author_GND | (DE-588)1075087538 |
| author_facet | Schumacher, Michaela 1986- |
| author_role | aut |
| author_sort | Schumacher, Michaela 1986- |
| author_variant | m s ms |
| building | Verbundindex |
| bvnumber | BV043002630 |
| ctrlnum | (OCoLC)929989224 (DE-599)DNB1076593623 |
| dewey-full | 573.84819353 |
| dewey-hundreds | 500 - Natural sciences and mathematics |
| dewey-ones | 573 - Specific physiological systems in animals |
| dewey-raw | 573.84819353 |
| dewey-search | 573.84819353 |
| dewey-sort | 3573.84819353 |
| dewey-tens | 570 - Biology |
| discipline | Biologie |
| format | Thesis Book |
| fullrecord | <?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?><collection xmlns="http://www.loc.gov/MARC21/slim"><record><leader>01448nam a2200349 c 4500</leader><controlfield tag="001">BV043002630</controlfield><controlfield tag="003">DE-604</controlfield><controlfield tag="005">00000000000000.0</controlfield><controlfield tag="007">t|</controlfield><controlfield tag="008">151112s2015 gw ad|| m||| 00||| ger d</controlfield><datafield tag="015" ind1=" " ind2=" "><subfield code="a">15,H11</subfield><subfield code="2">dnb</subfield></datafield><datafield tag="016" ind1="7" ind2=" "><subfield code="a">1076593623</subfield><subfield code="2">DE-101</subfield></datafield><datafield tag="035" ind1=" " ind2=" "><subfield code="a">(OCoLC)929989224</subfield></datafield><datafield tag="035" ind1=" " ind2=" "><subfield code="a">(DE-599)DNB1076593623</subfield></datafield><datafield tag="040" ind1=" " ind2=" "><subfield code="a">DE-604</subfield><subfield code="b">ger</subfield></datafield><datafield tag="041" ind1="0" ind2=" "><subfield code="a">ger</subfield></datafield><datafield tag="044" ind1=" " ind2=" "><subfield code="a">gw</subfield><subfield code="c">XA-DE</subfield></datafield><datafield tag="049" ind1=" " ind2=" "><subfield code="a">DE-355</subfield><subfield code="a">DE-83</subfield></datafield><datafield tag="082" ind1="0" ind2=" "><subfield code="a">573.84819353</subfield><subfield code="2">22/ger</subfield></datafield><datafield tag="084" ind1=" " ind2=" "><subfield code="a">570</subfield><subfield code="2">sdnb</subfield></datafield><datafield tag="100" ind1="1" ind2=" "><subfield code="a">Schumacher, Michaela</subfield><subfield code="d">1986-</subfield><subfield code="e">Verfasser</subfield><subfield code="0">(DE-588)1075087538</subfield><subfield code="4">aut</subfield></datafield><datafield tag="245" ind1="1" ind2="0"><subfield code="a">Charakterisierung biochemischer Eigenschaften des P2Y1-Rezeptors in heterologen Expressionssystemen und dessen Gewebeexpression in einer BAC-transgenen TagRFP-P2Y1-Reportermaus</subfield><subfield code="c">vorgelegt von Michaela Schumacher</subfield></datafield><datafield tag="264" ind1=" " ind2="1"><subfield code="c">2015</subfield></datafield><datafield tag="300" ind1=" " ind2=" "><subfield code="a">166 S.</subfield><subfield code="b">Ill., graph. Darst.</subfield><subfield code="c">21 cm</subfield></datafield><datafield tag="336" ind1=" " ind2=" "><subfield code="b">txt</subfield><subfield code="2">rdacontent</subfield></datafield><datafield tag="337" ind1=" " ind2=" "><subfield code="b">n</subfield><subfield code="2">rdamedia</subfield></datafield><datafield tag="338" ind1=" " ind2=" "><subfield code="b">nc</subfield><subfield code="2">rdacarrier</subfield></datafield><datafield tag="502" ind1=" " ind2=" "><subfield code="a">Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2015</subfield></datafield><datafield tag="655" ind1=" " ind2="7"><subfield code="0">(DE-588)4113937-9</subfield><subfield code="a">Hochschulschrift</subfield><subfield code="2">gnd-content</subfield></datafield><datafield tag="856" ind1="4" ind2="2"><subfield code="m">B:DE-101</subfield><subfield code="q">application/pdf</subfield><subfield code="u">http://d-nb.info/1076593623/04</subfield><subfield code="3">Inhaltsverzeichnis</subfield></datafield><datafield tag="856" ind1="4" ind2="2"><subfield code="m">DNB Datenaustausch</subfield><subfield code="q">application/pdf</subfield><subfield code="u">http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=028427825&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA</subfield><subfield code="3">Inhaltsverzeichnis</subfield></datafield><datafield tag="943" ind1="1" ind2=" "><subfield code="a">oai:aleph.bib-bvb.de:BVB01-028427825</subfield></datafield></record></collection> |
| genre | (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content |
| genre_facet | Hochschulschrift |
| id | DE-604.BV043002630 |
| illustrated | Illustrated |
| indexdate | 2024-12-20T17:25:23Z |
| institution | BVB |
| language | German |
| oai_aleph_id | oai:aleph.bib-bvb.de:BVB01-028427825 |
| oclc_num | 929989224 |
| open_access_boolean | |
| owner | DE-355 DE-BY-UBR DE-83 |
| owner_facet | DE-355 DE-BY-UBR DE-83 |
| physical | 166 S. Ill., graph. Darst. 21 cm |
| publishDate | 2015 |
| publishDateSearch | 2015 |
| publishDateSort | 2015 |
| record_format | marc |
| spellingShingle | Schumacher, Michaela 1986- Charakterisierung biochemischer Eigenschaften des P2Y1-Rezeptors in heterologen Expressionssystemen und dessen Gewebeexpression in einer BAC-transgenen TagRFP-P2Y1-Reportermaus |
| subject_GND | (DE-588)4113937-9 |
| title | Charakterisierung biochemischer Eigenschaften des P2Y1-Rezeptors in heterologen Expressionssystemen und dessen Gewebeexpression in einer BAC-transgenen TagRFP-P2Y1-Reportermaus |
| title_auth | Charakterisierung biochemischer Eigenschaften des P2Y1-Rezeptors in heterologen Expressionssystemen und dessen Gewebeexpression in einer BAC-transgenen TagRFP-P2Y1-Reportermaus |
| title_exact_search | Charakterisierung biochemischer Eigenschaften des P2Y1-Rezeptors in heterologen Expressionssystemen und dessen Gewebeexpression in einer BAC-transgenen TagRFP-P2Y1-Reportermaus |
| title_full | Charakterisierung biochemischer Eigenschaften des P2Y1-Rezeptors in heterologen Expressionssystemen und dessen Gewebeexpression in einer BAC-transgenen TagRFP-P2Y1-Reportermaus vorgelegt von Michaela Schumacher |
| title_fullStr | Charakterisierung biochemischer Eigenschaften des P2Y1-Rezeptors in heterologen Expressionssystemen und dessen Gewebeexpression in einer BAC-transgenen TagRFP-P2Y1-Reportermaus vorgelegt von Michaela Schumacher |
| title_full_unstemmed | Charakterisierung biochemischer Eigenschaften des P2Y1-Rezeptors in heterologen Expressionssystemen und dessen Gewebeexpression in einer BAC-transgenen TagRFP-P2Y1-Reportermaus vorgelegt von Michaela Schumacher |
| title_short | Charakterisierung biochemischer Eigenschaften des P2Y1-Rezeptors in heterologen Expressionssystemen und dessen Gewebeexpression in einer BAC-transgenen TagRFP-P2Y1-Reportermaus |
| title_sort | charakterisierung biochemischer eigenschaften des p2y1 rezeptors in heterologen expressionssystemen und dessen gewebeexpression in einer bac transgenen tagrfp p2y1 reportermaus |
| topic_facet | Hochschulschrift |
| url | http://d-nb.info/1076593623/04 http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=028427825&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA |
| work_keys_str_mv | AT schumachermichaela charakterisierungbiochemischereigenschaftendesp2y1rezeptorsinheterologenexpressionssystemenunddessengewebeexpressionineinerbactransgenentagrfpp2y1reportermaus |