Die Methylbindeproteine MBD2 und MBD3 unterscheiden sich hinsichtlich ihres genomweiten Bindeverhaltens an methylierten CpG-Inseln, Promotoren und Exon-Sequenzen, sowie ihres Einflusses auf die Genexpression:
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2013
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS 3
INHALTSVERZEICHNIS
1 ZUSAMMENFASSUNG/ABSTRACT 7
1.1 ZUSAMMENFASSUNG 7
1.2 ABSTRACT 9
2 EINLEITUNG 10
2.1 CHROMATINMODIFIKATIONEN UND GENEXPRESSION 11
2.2 MBD2 UND MBD3: KERNKOMPONENTEN SICH AUSSCHLIESSENDER NURD-KOMPLEXE 16
2.3 ALTERNATIVES SPLEISSEN
- MECHANISMEN ZUR STEIGERUNG DER PROTEINDIVERSITAET 19
2.4 ZIELSETZUNG DER ARBEIT 21
3 MATERIAL 23
3.1 GERAETE 23
3.2 VERBRAUCHSMATERIALIEN 24
3.3 CHEMIKALIEN 24
3.4 ENZYME, REAKTIONSPUFFER 25
3.5 KOMPLETTSYSTEME 25
3.6 DNA-LAENGENSTANDARDS (MBI) 26
3.7 PROTEIN-LAENGENSTANDARDS (MBI FERMENTAS) 26
3.8 OLIGONUKLEOTIDE 26
3.9 ANTIKOERPER 28
3.10 ANTIBIOTIKA 29
3.11 VEKTOREN UND KONSTRUKTE 29
3.12 ZELLLINIEN 30
3.12.1 EUKARYOTISCHE ZELLLINIEN 30
3.12.2 BAKTERIEN 31
4 METHODEN 32
4.1 ARBEITEN MIT DNA 32
4.1.1 LAGERUNG VON DNA 32
4.1.2 GEWINNUNG GENOMISCHER DNA UND NAAC-FAELLUNG 32
4.1.3 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA 33
4.1.4 PLASMIDPRAEPARATION IM KLEINEN MASSSTAB (MINI-PRAEP) 34
4.1.5 PLASMIDPRAEPARATION IM MITTLEREM MASSSTAB (MIDI-PRAEP) 35
4.1.6 RESTRIKTIONSSPALTUNG 35
4.1.7 AUFFUELLEN VON 5 -ENDEN 36
4.1.8 LIGATION 36
4.1.9 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 36
4.1.10 REAL-TIME PCR 38
4.1.11 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 38
4.1.12 GELEXTRAKTION 39
4.1.13 SEQUENZIERUNG 40
4.2 ARBEITEN MIT RNA 40
4.2.1 LAGERUNG VON RNA 40
4.2.2 ISOLATION VON RNA AUS EUKARYOTISCHEN ZELLEN 40
4.2.3 DNASE-VERDAU 41
4.2.4 BESTIMMUNG DER RNA-KONZENTRATION 41
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INHALTSVERZEICHNIS 4
4.2.5 REVERSE TRANSKRIPTION (RT)-PCR 42
4.3 ARBEITEN MIT BAKTERIEN 42
4.3.1 VERMEHRUNG UND LAGERUNG 42
4.3.2 TRANSFORMATION VON BAKTERIENKULTUREN MIT FREMD-DNA 43
4.4 ARBEITEN MIT EUKARYOTISCHEN ZELLKULTUREN 43
4.4.1 KULTIVIERUNG EUKARYOTISCHER ZELLEN 44
4.4.2 EINFRIEREN UND AUFTAUEN EUKARYOTISCHER ZELLEN 45
4.4.3 TRANSIENTE TRANSFEKTION VON EUKARYOTISCHE ZELLEN 46
4.4.4 HERSTELLUNG STABILER ZELLKLONE 47
4.4.5 RNA-TRANFER IN EUKARYOTISCHE ZELLEN (RNA-INTERFERENZ) 48
4.4.6 LUZIFERASE-ASSAY 48
4.5 ARBEITEN MIT PROTEINEN 49
4.5.1 LAGERUNG VON PROTEINEN 49
4.5.2 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION 50
4.5.3 ISOLIERUNG VON PROTEINEN 50
4.5.4 SDS-POELYACRYLAMID-GELELEKTORPHORESE 51
4.5.5 WESTERN BLOT 53
4.6 CHROMATIN-IMMUNOPRAEZIPITATION (CHIP) UND CHLP-SEQ-ANALYSE 54
4.6.1 CHIP 54
4.6.2 CHLP-SEQ 56
4.6.3 ANALYSE DER CHEP-SEQ-PROFILE 57
4.7 GENEXPRESSIONSANALYSE MITTELS MICROARRAY 58
4.8 COMBINED BISULFIT RESTRICTION ANALYSIS (COBRA) 59
4.9 ANALYSE DES
CHROMATINSTATUS MITTELS FLUORESZENZMIKROSKOPIE 60
4.9.1 LACO-LACI-MODELLSYSTEM 60
4.9.2 DNA-GEGENFARBUNG UND FIXIERUNG 60
5 ERGEBNISSE 62
5.1 HERSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON STABILEN LACO-ARRAY-ZELLLINIEN
62
5.1.1 HERSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG STABILER U20S- UND
MCF7-ZELLKLONE 62
5.1.2 CHARAKTERISIERUNG DER F42B8- (U20S) UND RREB1- (CHO) ZELLKLONE 63
5.2 MBD2-BINDUNG AN EUCHROMATIN FUEHRT ZU EINER VERDICHTUNG DES
CHROMATINS 66
5.2.1 DIE BINDUNG VON PRMT5, HDAC1 SOWIE MBD3 FUEHRT ZU KEINER AENDERUNG
DER
AUSDEHNUNG DES EUCHROMATISCHEN LACO-ARRAYS 66
5.2.2 DIE BINDUNG VON MBD2A UND MBD2B RESULTIERT IN EINER DRASTISCHEN
KOMPAKTIERUNG DES
EUCHROMATISCHEN LACO-ARRAYS 67
5.2.3 DIE GFP-ALACI-MBD2B MUTANTE ZEIGT KEINE BINDUNG AN DEN LACO-ARRAY
IN
RRE_B1-ZELLEN 69
5.3 DIE DURCH MBD2 HERBEIGEFUEHRTE KOMPAKTIERUNG DES EUCHROMATISCHEN
LACO-
ARRAYS IST NICHT DURCH IPTG REGULIERBAR 70
5.3.1 DIE BINDUNG VON GFP-LACI AN DEN LACO-ARRAY KANN DURCH IPTG
REGULIERT
WERDEN 71
5.3.2 DIE BINDUNG VON GFP-LACI-MBD2A UND GFP-LACI-MBD2B AN DEN LACO-
ARRAY KANN NICHT DURCH IPTG BLOCKIERT WERDEN 72
5.3.3 DIE BINDUNG VON CHERRY-LACI-MBD2B AN DEN LACO-ARRAY KANN NICHT
DURCH
IPTG BLOCKIERT WERDEN 73
5.4 MBD2 VERMITTELT EINEN AUSTAUSCH VON AKTIVEN DURCH REPRIMIERENDE
HISTONMODIFIKATIONEN, NICHT ABER DIE METHYLIERUNG SPEZIFISCHER CYTOSINE
74
5.4.1 KEINE METHYLIERUNG AN AUSGEWAEHLTEN CPGS INNERHALB DES LACO-ARRAYS
NACH
BINDUNG VON MBD2 75
INHALTSVERZEICHNIS
5
5.4.2 DIE BINDUNG VON MBD2 FUEHRT ZUR VERSCHIEBUNG DER H3K9AC- ZUR
H3K9ME3-
MODIFIKATION AM EUCHROMATISCHEN LACO-ARRAY 77
5.5 DIE BINDUNG VON MBD2 RESULTIERT IN GENREPRESSION 80
5.5.1 HERSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG STABILER PGL3
-LACO-HELA-ZELLKLONE 80
5.5.2 GFP-LACI-MBD2 UND GFP-LACI-MBD3 WERDEN IN GLEICHEM MASS EXPRIMIERT
UND BINDEN AN DEN REPORTER 81
5.5.3 DIE BINDUNG VON MBD2, NICHT VON MBD3 AN DEN REPORTER VERRINGERT
DIE
EXPRESSION DES REPORTERGENS 83
5.5.4 MBD2, NICHT ABER MBD3 VERMITTELT EINE VERSCHIEBUNG VON AKTIVEN ZU
REPRIMIERENDEN HISTONMODIFIKATIONEN AM REPORTER-GEN 86
5.6 MBD2 UND MBD3 UNTERSCHEIDEN SICH IN IHREM BINDEVERHALTEN AN
METHYLIERTEN
CPG-INSELN, PROMOTOREN UND EXON-BEREICHEN 87
5.6.1 V5-MBD2 UND V5-MBD3 KOENNEN GLEICHERMASSEN IN HELA ZELLEN EXPRIMIERT
WERDEN 88
5.6.2 ETABLIERUNG DES V5-CHIP 89
5.6.3 MBD2 BESITZT MEHR ENDOGENE BINDESTELLEN ALS MBD3 (VALIDIERUNG DER
CHLP-
SEQ ERGEBNISSE) 92
5.6.4 VALIDIERUNG ENDOGENER MBD2-UND MBD3-BINDESTELLEN 93
5.6.5 MBD2 UND MBD3 BINDEN AEHNLICHE ZIELSEQUENZEN 96
5.6.6 MBD2 BINDET BEVORZUGT METHYLIERTE DNA, MBD3 HINGEGEN IST MIT
AKTIVEN
CHROMATINMARKERN ASSOZIIERT 98
5.6.7 MBD2 ZEIGT IM GEGENSATZ ZU MBD3 EXON SPEZIFISCHE BINDUNG 101
5.7 UNTER DEN GETESTETEN BEDINGUNGEN KONNTE KEINE VERBINDUNG ZWISCHEN
DER MBD2-
EXON-BINDUNG UND SPLEISSVORGAENGEN GEZEIGT WERDEN 103
5.8 MBD2-BINDUNG STEHT HAUPTSAECHLICH IM ZUSAMMENHANG MIT GENREPRESSION,
WOHINGEGEN SOWOHL MBD2 UND MBD3 GEBUNDENE GENE AKTIVIERT SIND 108
5.8.1 REDUZIERUNG DER MBD2- UND MBD3-EXPRESSIONSLEVEL IN HELA-ZELLEN 108
5.8.2 GENOMWEITE EXPRESSIONSANALYSE UND VALIDIERUNG DER MICROARRAY-DATEN
AN
AUSGEWAEHLTEN KANDIDATENGENEN 109
5.8.3 MBD3 GEBUNDENE GENE ZEIGEN EINE HOEHERE EXPRESSION ALS MBD2
GEBUNDENE
GENE 113
6 DISKUSSION 117
6.1 RRE_B
1 -ZELLEN: BASIS DER ANALYSE DES EINFLUSSES VON MBD2 UND MBD3 AUF
EUCHROMATISCHE CHROMATINSTRUKTUREN 117
6.2 MBD2 IM GEGENSATZ ZU PRMT5, HDAC1 UND MBD3 KANN DIE KOMPAKTIERUNG
EUCHROMATISCHER STRUKTUREN INDUZIEREN 119
6.3 MBD2, IM GEGENSATZ ZU MBD3, INDUZIERT DIE EINFUHRUNG
HETEROCHROMATISCHER
HISTONMODIFIKATIONEN UND DIE REPRESSION EINES REPORTERGENS 121
6.4 MBD2 UND MBD3 BINDEN AEHNLICHE ZIELSEQUENZEN UNTERSCHEIDEN SICH ABER
IN IHREM
BINDEVERHALTEN AN METHYLIERTEN CPG-INSELN UND AKTIVEN
HISTONMODIFIKATIONEN 123
6.5 DIE EXONBINDUNG VON MBD2 ZEIGT KEINEN ZUSAMMENHANG ZU ALTERNATIVEM
SPLEISSEN
IN DEN DURCHGEFUEHRTEN EXPERIMENTELLEN ANSAETZEN 128
6.6 DIE BINDUNG VON MBD2 KORRELIERT MIT GENREPRESSION, WAEHREND GENE DIE
VON MBD2
UND MBD3 GEBUNDEN WERDEN IM ZUSAMMENHANG MIT GENAKTIVIERUNG STEHEN 130
6.7 AUSBLICK 132
7 ANHANG 135
7.1 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 135
7.2 VEKTORKARTEN 137
7.2.1 PGL3-LACO-REPORTER 137
INHALTSVERZEICHNIS 6
7.2.2 PSV-GFP-ALACI-MBD2B 138
7.2.3 PSV-GFP-ALACI 138
7.3 TABELLEN 139
8 LITERATURVERZEICHNIS 143
9 EIDESSTATTLICHE ERKLAERUNG 150
10 DANKSAGUNG 151
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