Vergleichende Genexpressionsprofilierung zur Charakterisierung zielgerichteter Krebstherapeutika an den Beispielen von FLT3-Kinaseinhibitoren und anti-CD20-Antikörpern:
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS I
1 EINLEITUNG 1
1.1 THERAPIE MALIGNER NEOPLASIEN 1
1.2 ZIELSTRUKTUREN FUER THERAPEUTIKA IM RAHMEN DIESER ARBEIT 3
1.2.1 DIE REZEPTORTYROSINKINASE FLT3 3
1.2.2 DER B-ZELLMARKER CD20 7
1.3 ANGEWANDTE TECHNOLOGIEN 10
1.3.1 RNA-INTERFERENZ 10
1.3.2 VERGLEICHENDE EXPRESSIONSANALYSE ALS MITTEL DER FUNKTIONELLEN
CHARAKTERISIERUNG 11
I
1.4 ZIELSETZUNG 12
2 MATERIAL UND METHODEN 13
2.1 GERAETE 13
2.1.1 ALLGEMEINE GERAETE 13
2.1.2 GERAETE FUER DIE ZELLKULTUR 13
2.1.3 GERAETE FUER ABSORPTIONS-, LUMINESZENZ- UND FLUORESZENZMESSUNGEN 13
2.1.4 GERAETE FUER QPCR 13
2.1.5 GERAETE FUER AFFYMETRIX-EXPERIMENTE 13
2.1.6 GERAETE FUER PROTEINANALYSEN 14
2.1.7 GERAETE FUER DIE DURCHFLUSSZYTOMETRIE 14
2.2 VERBRAUCHSMATERIAL 14
2.2.1 ALLGEMEINE VERBRAUCHSMATERIALIEN 14
2.2.2 VERBRAUCHSMATERIALIEN FUER DIE ZELLKULTUR 14
2.2.3 VERBRAUCHSMATERIALIEN FUER RNA-ISOLIERUNG UND REAL-TIME-PCR 14
2.2.4 VERBRAUCHSMATERIALIEN FUER PROTEINANALYTIK 15
2.2.5 VERBRAUCHSMATERIALIEN FUER AFFYMETRIX-ANALYSEN 15
2.3 REAGENZIEN UND KITS 15
2.3.1 ALLGEMEINE REAGENZIEN 15
2.3.2 REAGENZIEN UND KITS FUER ZELLBIOLOGISCHE EXPERIMENTE 15
2.3.2.1 ZELLKULTURMEDIEN UND -REAGENZIEN 15
2.3.2.2 REAGENZ FUER PROLIFERATIONSTESTS 16
2.3.2.3 T RANSF
EKTIONSREAGENZIEN 16
2.3.2.4 REAGENZIEN FUER DIE DURCHFLUSSZYTOMETRIE 16
2.3.2.5 KINASE-INHIBITOREN 16
2.3.3 ALLGEMEINE REAGENZIEN UND KITS FUER MOLEKULARBIOLOGISCHE
EXPERIMENTE 17
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INHALTSVERZEICHNIS II
2.3.4 REAGENZIEN UND LOESUNGEN FUER DIE PRAEPARATION DER AFFYMETRIX-PROBEN
18
2.3.5 REAGENZIEN UND KITS FUER PROTEINBIOCHEMISCHE EXPERIMENTE 19
2.3.5.1 LYSE UND SDS-GELELEKTROPHORESE 19
2.3.5.2 BESTIMMUNG DER GESAMTPROTEINKONZENTRATION 20
2.3.5.3 WESTERN BLOT 20
2.3.5.4 PRIMAERANTIKOERPER 20
2.3.5.5 SEKUNDAERANTIKOERPER FUER WESTERN BLOT 20
2.3.5.6 ELISAS 20
2.4 OLIGONUKLEOTIDE 21
2.4.1 SIRNAS 21
2.4.2 OLIGONUKLEOTIDE FUER DIE QPCR 21
2.5 ZELLLINIEN 22
2.6 SOFTWARE UND DATENBANKEN 22
I
2.7 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 23
2.7.1 QUANTITATIVE PCR (QPCR) 23
2.7.1.1 AUFREINIGUNG VON GESAMT-RNA 23
2.7.1.2 CDN
A-SYNTHESE 23
2.7.1.3 QUANTITATIVE PCR / REAL TIME PCR 23
2.7.2 PROBENVORBEREITUNG FUER DIE EXPRESSIONSPROFILIERUNG 24
2.7.2.1 CDN
A-SYNTHESE 24
2.7.2.2 AUFREINIGUNG DER CDNA 24
2.7.2.3 IN-VITRO-
T RANSKRIPTION 24
2.7.2.4 FRAGMENTIERUNG UND HYBRIDISIERUNG 24
2.8 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 25
2.8.1 ZELLKULTUR 25
2.8.2 VIABILITAETSBESTIMMUNG 25
2.8.3 TRANSFEKTIONEN 26
2.8.4 DURCHFLUSSZYTOMETRIE 26
2.9 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 26
2.9.1 GEWINNUNG VON ZELLLYSATEN 26
2.9.2 BESTIMMUNG DER GESAMTPROTEINKONZENTRATION (BCA) 26
2.9.3 SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 27
2.9.4 WESTERN BLOTTING 27
2.9.5 ELISA 28
2.10 ANALYSE DER GENEXPRESSION 28
2.10.1 FILTERUNG UND FUNKTIONELLE ANALYSEN 28
2.10.2 GENE SET ENRICHMENT ANALYSIS (GSEA) 29
INHALTSVERZEICHNIS
III
ERGEBNISSE 31
3.1 FLT3-MODULATION MIT NIEDERMOLEKULAREN SUBSTANZEN UND SIRNAS 31
3.1.1 EXPRESSIONSPROFILIERUNG VON ZELLLINIEN 31
3.1.2 CHARAKTERISIERUNG DER SIRNAS GEGEN FLT3 32
3.1.2.1 HERUNTERREGULATION VON FLT3-MRNA UND -PROTEIN DURCH FLT3-SIRNAS
32
3.1.2.2 VIABILITAET UND PROLIFERATION VON MV4;11-ZELLEN WERDEN DURCH
FLT3-SIRNAS STARK
BEEINTRAECHTIGT 35
3.1.2.3 AUSWIRKUNGEN DER FLT3-SIRNAS AUF DIE ZELLMORPHOLOGIE UND
ZELLZYKLUS 35
3.1.2.4 FLT3-SIRNA INDUZIERTE GENEXPRESSIONVERAENDERUNGEN BEI DER
ZELLLINE MV4;11.... 37
3.1.2.5 ANALYSEN ZUR AKTIVITAET UND EXPRESSION VON TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
45
3.1.3 CHARAKTERISIERUNG DER NIEDERMOLEKULAREN KINASEINHIBITOREN 48
3.1.3.1 HEMMUNG DER REKOMBINANTEN FLT3-KINASE (BIOCHEMISCHER TEST) 48
3.1.3.2 HEMMUNG DER FLT3-AKTIVIERUNG 49
3.1.3.3 I ERMITTLUNG DER ZELLULAEREN IC50 (PROLIFERATIONSTEST) 51
3.1.3.4 GENEXPRESSIONSANALYSE BEI MV4;11 NACH 24-STUENDIGER BEHANDLUNG
MIT
VERSCHIEDENEN INHIBITOREN 52
3.1.3.5 VERGLEICH DER FRUEHEN TRANSKRIPTIONSAENDERUNGEN NACH BEHANDLUNG
MIT INHIBITOREN
BZW. FLT3-SIRNAS 60
3.1.3.6 EXTRAPOLATION DER AKTIVITAET VON TRANSKRIPTIONSFAKTOREN DURCH DIE
BEHANDLUNG MIT
KINASEINHIBITOREN 64
3.2 AKTIVIEREN ANTIKOERPER GEGEN CD20 DIE B-ZELL-REZEPTOR-KASKADE? 67
3.2.1 TRANSKRIPTIONSAENDERUNGEN BEI VERSCHIEDENEN ZELLLINIEN NACH
BEHANDLUNGEN MIT ANTI-B-
ZELL-REZEPTOR-ANTIKOERPERN 67
3.2.2 TRANSKRIPTIONSAENDERUNGEN NACH BEHANDLUNG MIT ANTIKOERPERN GEGEN
CD20 70
3.2.3 VERGLEICH DER EXPRESSIONSAENDERUNGEN NACH ANTI-CD20-BEHANDLUNG UND
NACH ANTI-BCR-
BEHANDLUNG 70
3.2.4 VERGLEICH DER AKTIVIERUNGSMUSTER IN VERSCHIEDENEN ZELLLINIEN 72
3.2.5 EINFLUSS DER SYK-INHIBITION UND DER SIRNA-VERMITTELTEN
SYK-REPRESSION AUF DIE
BEHANDLUNG MIT ANTIKOERPERN GEGEN CD20 BZW. DEN BCR 76
DISKUSSION 79
4.1 FLT3-LNHIBITION 79
4.1.1 CHARAKTERISIERUNG DER VERWENDETEN INHIBITOREN 80
4.1.2 RNAI ALS SPEZIFISCHE MODULATION 85
4.1.3 HIERARCHISCHE CLUSTERBILDUNG ZUR ERMITTLUNG DER RELATIVEN
AEHNLICHKEIT 88
4.1.4 DIE EXPRESSIONSPROFILE DER BEHANDLUNGEN MIT FLT3-SIRNAS SIND
SPEZIFISCH 91
4.1.5 DIE FLT3-LNHIBITION INDUZIERT DIFFERENZIERUNG UND EINEN KINASE
SWITCH 92
4.1.6 FLT3- UND PIM1
-EXPRESSION BEEINFLUSSEN SICH GEGENSEITIG 92
4.2 DIE SIGNALWEGE DOWNSTREAM VON CD20 UND BCR INTERFERIEREN 94
4.2.1 ANTI-IGM/LGG-ANTIKOERPER AKTIVIEREN DEN BCR-SIGNALWEG 94
INHALTSVERZEICHNIS
IV
4.2.2 DER ANTI-CD20-ANTIKOERPER-INDUZIERTE SIGNALWEG UMFASST KOMPONENTEN
DES BCR-
SIGNALWEGS 95
4.3 VERGLEICH VON EXPRESSIONSMUSTERN 97
4.4 AUSBLICK 100
5 ZUSAMMENFASSUNG 101
6 VERZEICHNIS HAEUFIG
VERWENDETER ABKUERZUNGEN 102
7 ABBILDUNGS- UND TABELLENVERZEICHNIS 103
8 LITERATURVERZEICHNIS 107
9 APPENDIX 121
9.1 ERMITTLUNG DER ZELLULAEREN IC50 DER INHIBITOREN AUF MV4;11 UND RS4;
11 -ZELLEN 121
9.2 LISTEN DER GENEXPRESSIONSPROFILIERUNG (DOWNSTREAM) 122
9.2.1 DIFFERENTIELL EXPRIMIERTE GENE IN DER ZELLLINIE RS4;11
(FLT3-WILDTYP) NACH BEHANDLUNG
MIT DER FLT3-SIRNAS 122
9.2.2 MV4;11 UND FLT3-SIRNAS (BEHANDLUNGSDAUER 24 STUNDEN) 123
9.2.3 DOWNSTREAM-FUNKTIONEN BEI 24-STUENDIGER BEHANDLUNG VON MV4;11 MIT
VERSCHIEDENEN
INHIBITOREN 136
9.3 EXTRAPOLIERTE AKTIVITAET VON TRANSKRIPTIONSREGULATOREN, KINASEN UND
PHOSPHATASEN 137
9.3.1 EXTRAPOLIERTE AKTIVITAETSAENDERUNGEN VON TRANSKRIPTIONSFAKTOREN NACH
24-STUENDIGER
BEHANDLUNG BEI
DER ZELLLINIE MV4;11 137
9.3.2 EXTRAPOLIERTE AKTIVITAET VON KINASEN UND PHOSPHATASEN NACH
24-STUENDIGER BEHANDLUNG143
9.3.3 EXTRAPOLIERTE AKTIVITAETSAENDERUNGEN VON TRANSKRIPTIONSFAKTOREN NACH
VIER-, ACHT- BZW. 16-
STUENDIGER BEHANDLUNG 145
9.4 GENE SET ENRICHMENF-ANALYSEN 150
9.5 SCHNITTMENGEN DER TRANSKRIPTIONSMUSTER DER BEHANDLUNGEN MIT
KINASEINHIBITOREN 151
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