Molekulare Charakterisierung der Isocitratdehydrogenase von P. aeruginosa und deren Bedeutung im Rahmen der metabolischen Adaptation an die Mukoviszidose-Lunge:
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MIKROBIOLOGIE
LEHRSTUHL: BAKTERIOLOGIE
DER LUDWIG-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET MUENCHEN
VORSTAND: PROF. DR. DR. JUERGEN HEESEMANN
MOLEKULARE CHARAKTERISIERUNG DER ISOCITRATDEHYDROGENASE
VON P. AERUGINOSA UND DEREN BEDEUTUNG IM RAHMEN DER
METABOLISCHEN ADAPTATION AN DIE MUKOVISZIDOSE-LUNGE
DISSERTATION
ZUM ERWERB DES DOKTORGRADES DER NATURWISSENSCHAFTEN
AN DER MEDIZINISCHEN FAKULTAET
DER LUDWIG-MAXIMILIANS-UNIVERSITAET MUENCHEN
VORGELEGT VON
MARTIN ARNOLD
AUS WIESBADEN
2013
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 ZUSAMMENFASSUNG 1
2 SUMMARY 3
3 EINLEITUNG
.........................................................................5
3.1 MUKOVISZIDOSE 5
3.1.1 DAS CFTR-GEA 6
3.1.2 PATHOPHYSIOLOGIE DER MUKOVISZIDOSE 7
3.1.3 ABWEHRMECHANISMEN IN DER CF-LUNGE 8
3.1.4 KOLONISIERUNG DER CF-LUNGE DURCH PATHOGENE ERREGER 10
3.1.5 THERAPIEMOEGLICHKEITEN DER MUKOVISZIDOSE 12
3.2 PSEUDOMONAS AERUGINOSA 13
3.2.1 VIRULENZFAKTOREN VON P. AERUGINOSA 13
3.2.2 KOMMUNIKATION VON P. AERUGINOSA MITTELS QUORUM SENSING 17
3.2.3 METABOLISMUS VON P. AERUGINOSA 18
3.2.4 VERBINDUNG ZWISCHEN VIRULENZ UND METABOLISMUS 21
3.3 CHRONISCHE RESPIRATORISCHE INFEKTION DURCH P. AERUGINOSA BEI CF 22
3.3.1 MUTATOR- UND NON-MUTATOR-STAEMME 22
3.3.2 ADAPTATION VON P. AERUGINOSA AN DIE CF-LUNGE DURCH HORIZONTALEN
GENTRANSFER 23
3.3.3 PHAENOTYPISCHE ANPASSUNG VON P. AERUGINOSA AN DIE CF-LUNGE 26
3.4 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT 30
4 MATERIAL & METHODEN 32
4.1 MATERIAL 32
4.1.1 BAKTERIENSTAEMME
..TT. .
32
4.1.2 PLASMIDE 34
4.1.3 OLIGONUKLEOTIDE 35
4.1.4 DNA-SONDE FUER SOUTHERN BLOT 37
4.1.5 GERAETE, APPARATUREN UND ZUBEHOER 37
4.1.6 CHEMIKALIEN/SUBSTANZEN 38
4.1.7 KOMMERZIELLE REAGENZIENSAETZE (KITS) 41
4.1.8 NAEHRMEDIEN 41
4.1.9 ANTIBIOTIKA 44
4.1.10 PUFFER 44
4.1.11 GROESSENSTANDARDS 45
4.1.12 SOFTWARE 46
4.2 MOLEKULARGENETISCHE METHODEN 47
INHALTSVERZEICHNIS
4.2.1 AEROBE/ANAEROBE ANZUCHT VON P. AERUGINOSA, E. COLI UND S. AUREUS
47
4.2.2 ANLEGUNG EINER
GLYCERIN-KRYOKULTUR VON BAKTERIENSTAEMMEN 47
4.2.3 BESTIMMUNG DER OPTISCHEN
DICHTE (OD) EINER FLUESSIGKULTUR 47
4.2.4 BESTIMMUNG DER LEBENDZELLZAHL MIT DEM SPATELPLATTENVERFAHREN 47
4.2.5 ERSTELLEN EINER WACHSTUMSKURVE UND BESTIMMUNG
DER GENERATIONSZEIT 48
4.2.6 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA 48
4.2.7 ISOLIERUNG CHROMOSOMALER DNA AUS P. AERUGINOSA 48
4.2.8 LAGERUNG VON NUKLEINSAEUREN SO
4.2.9 HITZEDENATURIERUNG BAKTERIELLER GESAMT-DNA 50
4.2.10 POLYMERASE-KETTEN-REAKTION (PCR) 50
4.2.11 AUFTRENNUNG VON DNA NACH GROESSE MITTELS AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
51
4.2.12 AUFREINIGUNG VON DNA 52
4.2.13 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON
NUKLEINSAEUREN 52
4.2.14 SPALTUNG VON DNA MITTELS RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 52
4.2.15 DEPHOSPHORYLIERUNG VON PLASMID-DNA 53
4.2.16 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN 53
4.2.17 KLONIERUNG MIT DEM
TOPO TA CLONING
KIT 53
4.2.18 KONSTRUKTION EINER P. AERUGINORA-DELETIONSMUTANTE UND
-INSERTIONSMUTANTE 54
4.2.19 DNA-SEQUENZIERUNG 55
4.2.20 HERSTELLUNG CA
2+
-KOMPETENTER E. COLIS DH5A 55
4.2.21 TRANSFORMATION VON (PLASMID)-DNA IN CA
2+
-KOMPETENTEN E. COLIS 56
4.2.22 BLAU-WEISS-SELEKTION (A-KOMPLEMENTATION) 56
4.2.23 UEBERTRAGUNG VON PLASMID-DNA DURCH KONJUGATION 57
4.2.24 SOUTHERN BLOT 57
4.2.24.1 HERSTELLUNG EINER DIGOXIGENIN (DIG)-11-DUTP MARKIERTEN
DNA-SONDE 58
4.2.24.2 RESTRIKTIONSVERDAU CHROMOSOMALER DNA UND ANSCHLIESSENDER
TRANSFER AUF
NYLONMEMBRAN 58
4.2.24.3 HYBRIDISIERUNG MIT DIG-MARKIERTER DNA-SONDE 59
4.2.24.4 DIG-DETEKTION 60
4.3 MIKROBIOLOGISCHE METHODEN 60
4.3.1 WACHSTUM VON P. AERUGINOSA AUF SUPPLEMENTIERTEM MINIMALMEDIUM 60
4.3.2 BIOLOG-MICROARRAYS* ZUR IDENTIFIZIERUNG METABOLISCHER PHAENOTYPEN
60
4.3.3 TRANSKRIPTOMANALYSE MIT DEM GENECHIP PSEUDOMONAS AERUGINOSA 62
4.3.3.1 RNA-EXTRAKTION ZUR TRANSKRIPTOMSANALYSE 62
4.3.3.2 GROESSENBESTIMMUNG UND VERDAU DER RNA 62
4.3.3.3 SYNTHESE, FAELLUNG UND AUFREINIGUNG VON CDNA FUER DIE
GENEXPRESSIONSANALYSE 63
INHALTSVERZEICHNIS
4.3.3.4 FRAGMENTIERUNG DER CDNA MIT KONTROLLE 64
4.3.3.5 TERMINAL LABELING MIT KONTROLLE 65
4.3.3.6 HYBRIDISIERUNG, WASCHEN UND ANFAERBEN 65
4.3.3.7 GENCHIP-DATEN: DETEKTION, QUALIFIKATION UND STATISTIK 65
4.3.4 MOTILITAETS-VERSUCHE 66
4.3.4.1 BESTIMMUNG DER SCHWAERM-MOTILITAET 66
4.3.4.2 BESTIMMUNG DER
SCHWIMM-MOTILITAET 66
4.3.4.3 BESTIMMUNG DER TVW/CMNG-MOTILITAET 67
4.3.5 BESTIMMUNG DER ELASTASE-AKTIVITAET 67
4.3.6 BESTIMMUNG DER GESAMT-PROTEASE-AKTIVITAET 67
4.3.7 BESTIMMUNG DER RELATIVEN PYOCYANIN-PRODUKTION 67
4.3.8 BESTIMMUNG DER
BIOFILM-BILDUNG DURCH P. AERUGINOSA 68
4.3.9 EISEN-, OSMOTISCHER UND OXIDATIVER STRESS BEI P. AERUGINOSA 68
4.3.10 BESTIMMUNG DER UEBERLEBENSRATE VON P. AERUGINOSA BEI ZUGABE VON
PARAQUAT 69
4.3.11 EPSILOMETER-T
EST (E-T
EST) 69
4.3.12 BESTIMMUNG DER MINIMALEN HEMMKONZENTRATION (MHK) 70
4.3.13 BESTIMMUNG DER INTR. NAD(H)- BZW. NADP(H)-KONZENTRATION VON P.
AERUGINOSA.... 70
4.3.14 ISOLIERUNG VON LIPOPOLYSACCHARIDEN (LPS) 71
4.4 BIOCHEMISCHE METHODEN 72
4.4.1 MECHANISCHER ZELLAUFSCHLUSS DURCH ULTRASCHALL 72
4.4.2 QUANTITATIVE PROTEINBESTIMMUNG (BRADFORD-TEST) 72
4.4.3 MESSUNG DER IDH-ENZYM-AKTIVITAET 73
4.4.4 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 73
4.4.5 COOMASSIE-FAERBUNG BEI POLYACRYLAMIDGELEN ..: 75
4.4.6 SILBERFARBUNG BEI POLYACRYLAMIDGELEN 75
4.4.7 BLUE-NATIVE-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (BN-PAGE) 76
4.4.7.1 HERSTELLUNG VON GRADIENTENGELE FUER DIE BN-PAGE 76
4.4.7.2 HERSTELLUNG DES ROHEXTRAKTS FUER DIE BN-PAGE 77
4.4.7.3 ELEKTROPHORESE BEI DER BN-PAGE 77
4.4.7.4 ENZYM-AKTIVITAETSFARBUNG IM GEL NACH DER BN-PAGE 78
4.4.8 BESTIMMUNG DER SUPEROXIDDISMUTASE-AKTIVITAET 79
4.4.9 BESTIMMUNG DER SS-LAKTAMASE-AKTIVITAET 80
4.4.10 BESTIMMUNG UND EINFLUSS DER AMPC-SS-LAKTAMASE AUF DIE
ANTIBIOTIKA-RESISTENZ 81
4.5 ISOTOPOLOG-EXPERIMENTE ZUR BESTIMMUNG DES METABOLISCHEN
KOHLENSTOFFFLUSSES 81
4.5.1 HERSTELLUNG VON ASM MIT
3
C-MARKIERTEN UND UNMARKIERTEN FETTSAEUREN 81
4.5.2 BAKTERIENANZUCHT IN MODIFIZIERTEM ASM FUER ISOTOPOLOG-EXPERIMENTE
82
INHALTSVERZEICHNIS
5 ERGEBNISSE 84
5.1 BEDEUTUNG DER ISOCITRAT- UND MALATDEHYDROGENASE
VON P. AERUGINOSA 84
5.1.1 KONSTRUKTION DER ISOCITRATDEHYDROGENASE-(IDH)-DOPPELMUTANTE 84
5.1.2 KONSTRUKTION DER MALATDEHYDROGENASE-MDH-MUTANTE 87
5.1.3 UEBERPRUEFUNG DER IDH-DOPPELMUTANTE PA 4AICDAIDH UND MDH-MUTANTE PAH
MDH::GM DURCH SOUTHERN BLOT-HYBRIDISIERUNG 88
5.2 WACHSTUMSVERSUCHE MIT P. AERUGINOSA IN FLUESSIGMEDIEN 89
5.2.1 AEROBES WACHSTUM DER IDH-DOPPELMUTANTE PAL4AICDAIDH 89
5.2.2 ANAEROBES WACHSTUM DER IDH-DOPPELMUTANTE PA14AICDAIDH 92
5.2.3 AEROBES WACHSTUM DER MDH-MUTANTE PAH MDH::GM 94
5.2.4 AEROBES WACHSTUM VON P. AERUGINOSA IN ABHAENGIGKEIT VOM PH-WERT 96
5.3 UEBERPRUEFUNGEN DER KATALYTISCHEN IDH-ENZYMFUNKTIONALITAET 97
5.3.1 BESTIMMUNG DER ENZYM-AKTIVITAET DER ISOCITRATDEHYDROGENASE-MUTANTEN
97
5.3.2 UEBERPRUEFUNG DER IDH-ENZYM-AKTIVITAETEN IM GEL NACH BN-PAGE 98
5.4 METABOLISCHE ANALYSEN MIT P. AERUGINOSA 99
5.4.1 BIOLOG-M CROARRAYS* VON PAH, P AI 4 AICDAIDH UND PAH MDH::GM 99
5.4.2 WACHSTUM VON PAH, ?AL4AICDAIDH UND PAH MDH::QM AUF SUPPL. C-MM 102
5.4.3 ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE AUS DEN BIOLOG- UND
C-MM-EXPERIMENTEN 103
5.4.4 BESTIMMUNG DES
KOHLENSTOFFFLUSSES VON PAH UND P A 4 AICDAIDH MITTELS LSOTOPOLOGUE
PROFILING 104
5.4.5 TRANSKRIPTOMANALYSEN VON PAH UND ISOCITRATDEHYDROGENASE-MUTANTEN
106
5.4.5.1 TRANSKRIPTOMANALYSENVERGLEICH ZWISCHEN PAH ICD::TN UND PAH 107
5.4.5.2 TRANSKRIPTOMANALYSENVERGLEICH ZWISCHEN PAH IDH::TN UND PAH 108
5.4.5.3 TRANSKRIPTOMANALYSENVERGLEICH ZWISCHEN PAH IDH YX UND PAH
ICD:: TN 109
5.4.5.4 TRANSKRIPTOMANALYSENVERGLEICH ZWISCHEN
VA 4AICDAIDH UND PAH 110
5.5 CHARAKTERISIERUNG DER EXPRESSION VON VIRULENZFAKTOREN BEI P.
AERUGINOSA 114
5.5.1 BAKTERIELLE MOTILITAET VON P. AERUGINOSA 114
5.5.1.1 BESTIMMUNG DER ISW/FFWI/NG-MOTILITAET VON P. AERUGINOSA 115
5.5.1.2 BESTIMMUNG DER TWITCHING-MOXI I AET VON P. AERUGINOSA 115
5.5.1.3 BESTIMMUNG DER
SWWM/NG-MOTILITAET VON P. AERUGINOSA 116
5.5.2 BESTIMMUNG DER RELATIVEN BIOFILM-BILDUNG VON P. AERUGINOSA 117
5.5.3 BESTIMMUNG DER ELASTASE-AKTIVITAET VON P. AERUGINOSA 119
5.5.4 BESTIMMUNG DER GESAMT-PROTEASE-AKTIVITAET VON P. AERUGINOSA 121
5.5.5 BESTIMMUNG DER PYOCYANIN-PRODUKTION VON P. AERUGINOSA 121
5.6 EINFLUSS VON OXIDATIVEN STRESS AUF P. AERUGINOSA 122
5.6.1 BESTIMMUNG DER RESISTENZ VON P. AERUGINOSA GEGENUEBER PARAQUAT 123
5.6.2 MOEGLICHE URSACHEN FUER EINE ERHOEHTE PARAQUAT-RESISTENZ VON P A 4
AICDAIDH 125
INHALTSVERZEICHNIS
5.6.3 ANTIBIOTIKA-RESISTENZVERHALTEN VON P. AERUGINOSA 133
5.6.4 BESTIMMUNG DER MHK VON P. AERUGINOSA MITTELS EPSILOMETER-TEST
(E-TEST) 135
5.6.5 BESTIMMUNG DER SS-LAKTAMASE-AKTIVITAET VON PA14, PAL4AICDAIDH UND
PAHAICDAIDH
(PICD/IDH) 136
5.6.6 BESTIMMUNG DER SS-LAKTAMASE AMPC VON PA14 UND PAL4AICDAIDH 137
5.7 CHARAKTERISIERUNG DER CF-ISOLATE ML MIT M25 139
5.7.1 WACHSTUMSVERSUCHE MIT DEN CF-ISOLATEN ML UND M25 IN FLUESSIGMEDIEN
139
5.7.1.1 AEROBES WACHSTUM VON ML UND M25 139
5.7.1.2 ANAEROBES WACHSTUM VON ML UND M25 140
5.7.2 BESTIMMUNG DER ISOCITRATDEHYDROGENASE-AKTIVITAET VON M1 UND M25 141
5.7.3 VIRULENZFAKTOREN BEI ML UND M25 142
5.7.3.1 BESTIMMUNGEN DER MOTILITAET VON ML UND M25 142
5.7.3.2 VERGLEICHENDE BESTIMMUNGEN DER BIOFILM-BILDUNG VON ML UND M25
143
5.7.3.3 SEKRETIERTE VIRULENZFAKTOREN (ELASTASE, PROTEASEN UND PYOCYANIN)
DURCH ML UND
M25 144
5.7.3.4 ERSTELLUNG DES LPS-PROFILS VON ML UND M25 144
5.7.3.5 BESTIMMUNG DER PARAQUAT-RESISTENZ VON ML UND M25 144
5.8 IDENTIFIZIERUNG VON PUNKTMUTATIONEN (SNPS) IN ICD UND IDH BEI DEN
SEQUENTIELLEN CF-
ISOLATEN ML UND M25 VON P. AERUGINOSA 145
5.8.1 VERGLEICH DER WACHSTUMSRATEN BEI IDH-VARIANTEN VON P. AERUGINOSA
148
5.8.2 EINFLUSS DER SNPS AUF DIE IDH-ENZYM-AKTIVITAET VON P. AERUGINOSA
150
5.8.3 PHAENOTYPISCHE CHARAKTERISIERUNGEN DER SNP-KOMPLEMENTIERTEN STAEMME
152
5.8.3.1 VERGLEICH DER SCHWIMM-MOTILITAET 152
5.8.3.2 VERGLEICH DER 2VVIFCAING-MOTILITAET 152
5.8.3.3 VERGLEICH DER SCHWAERM-MOTILITAET 153
5.8.3.4 VERGLEICH DER ELASTASE-AKTIVITAET 154
5.8.3.5 VERGLEICH DER GESAMT-PROTEASE-AKTIVITAET 155
5.8.3.6 VERGLEICH DER PYOCYANIN-PRODUKTION 155
5.8.3.7 VERGLEICH DER PARAQUAT-RESISTENZ 156
5.9 VERGLEICHENDE GENOMANALYSE DER CF-ISOLATE ML UND M25 158
6 DISKUSSION 162
6.1 ANPASSUNG VON P. AERUGINOSA AN DIE BEDINGUNGEN DER
CHRONISCH-INFIZIERTEN CF-LUNGE.. 162
6.1.1 KONSTRUKTION DER IDH-DOPPELMUTANTE UND MDH-MUTANTE VON P.
AERUGINOSA 164
6.1.2 EINFLUSS DER ISOCITRAT- UND MALATDEHYDROGENASE AUF DAS
WACHSTUMSVERHALTEN BEI
UNTERSCHIEDLICHEN WACHSTUMSBEDINGUNGEN 164
6.1.3 AUSWIRKUNGEN DER IDH-INAKTIVIERUNG AUF DAS TRANSKRIPTOM VON P.
AERUGINOSA 170
6.2 AUSWIRKUNGEN DER DELETION VON ICD, IDH BZW. MDH AUF DIE EXPRESSION
VON VIRULENZFAKTOREN
BEI P. AERUGINOSA PA14 172
INHALTSVERZEICHNIS
6.2.1 BEEINTRAECHTIGUNG DER MOTILITAET VON P. AERUGINOSA DURCH
INAKTIVIERUNG DER IDH 172
6.2.2 AUSWIRKUNGEN DER IDH-INAKTIVIERUNG AUF DIE BIOFILM-BILDUNG VON P.
AERUGINOSA... 174
6.2.3 EINFLUSS DER IDH-INAKTIVIERUNG AUF SEKRETIERTE VIRULENZFAKTOREN
175
6.2.4 ERHOEHTE TOLERANZ VON P. AERUGINOSA GEGENUEBER OXIDATIVEM STRESS 177
6.2.5 EINFLUSS DER IDH-INAKTIVIERUNG AUF DIE ANTIBIOTIKA-RESISTENZ VON
P. AERUGINOSA 182
6.3 PHAENO- UND GENOTYPISCHER VERGLEICH VON PA14 UND PA14AIC /A/D/I MIT
ML UND M25 185
6.4 AUSWIRKUNGEN VON SNPS AUF DIE ADAPTATION AN DIE CF-LUNGE 186
6.5 BEDEUTUNG DER INAKTIVIERUNG VON ICD UND IDH FUER
METABOLISMUS/VIRULENZ VON P. AERUGINOSA
187
7 LITERATURVERZEICHNIS 192
8 ANBANG 229
8.1 PHAENOTYPISCHE MICROARRAYS* (BIOLOG) 229
8.1.1 KOHLENSTOFF-ZUSAMMENSTELLUNG DER MIKROTITERPLATTE PM1 229
8.1.2 VERSTOFFWECHSELUNG VON C-QUELLEN (PM1) NACH 24 H
(BIOLOG-EXPERIMENTE) 230
8.1.3 AS- UND STICKSTOFF-ZUSAMMENSTELLUNG DER MIKROTITERPLATTE PM3 232
8.1.4 ABBILDUNGEN DER MIKROTITERPLATTEN (PM3) NACH 24 H
(ENDPUNKTBESTIMMUNG) 232
8.1.5 VERSTOFFWECHSELUNG VON AS-/N-QUELLEN (PM3) NACH 24 H
(BIOLOG-EXPERIMENTE).... 233
8.2 TRANSKRIPTOM-DATEN 235
8.2.1 TRANSKRIPTOMANALYSENVERGLEICH ZWISCHEN PA14 ICD::TN UND PA14 235
8.2.2 TRANSKRIPTOMANALYSENVERGLEICH ZWISCHEN PAH IDH::TN UND PAH 238
8.2.3 TRANSKRIPTOMANALYSENVERGLEICH ZWISCHEN PA 4AICDAIDH UND PAH 240
8.3 LPS-PROFILE 247
8.4 SEQUENZALIGNMENTS VON P. AERUGINOSA CF-ISOLATEN MIT PA01/PA14 248
8.4.1 SEQUENZALIGNMENT VON P. AERUGINOSA-STAEMMEN FUER DAS GEN ICD UND
PROTEIN ICD 248
8.4.2 SEQUENZALIGNMENT VON P. AERUGINOSA-STAEMMEN FUER DEN INTERGENISCHEN
BEREICH 258
8.4.3 SEQUENZALIGNMENT VON P. AERUGINOSA-STAEMMEN FUER DAS GEN IDH UND
PROTEIN IDH 260
8.5 VERGLEICH DER GENOME VON ML UND M25 276
8.5.1 STATISTISCHE DATEN ZUR SEQUENZIERUNG DER CF-ISOLATE ML UND M25 276
8.5.2 SNP- UND INDEL-ANALYSE VON ML UND M25 277
I. ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 308
II. ABBILDUNGSVERZEICHNIS 313
III. TABELLENVERZEICHNIS 316
IV. DANKSAGUNG 318
V. EIDESSTATTLICHE VERSICHERUNG 319
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