Experimentelle Untersuchungen zur Inaktivierung von Viren, die hämorrhagische Fieber auslösen in klinischen Proben (Marburg-Virus, Ebola-Virus) für die anschließende gefahrlose Bestimmung viraler Antigene und Genome: Herstellung monoklonaler Antikörper gegen Marburg-Virus und Austestung deren Eignung für Marburg-Virus-Antigen-Nachweissysteme
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Streitkräfteamt, Abt. III, Fachinformationszentrum der Bundeswehr
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Autor: Becker, Stephan
Jahr: 2009
-5-
III. Inhaltsverzeichnis
I Kurzfassung 3
II Summary 4
III Inhaltsverzeichnis 5
1. Einleitung 7
2. Stand der Forschung 8
2.1 Taxonomie und Epidemiologie 8
2.2 Klinik und Pathogenese 10
2.3 Struktur der Filoviren 12
2.4 Genomaufbau der Filoviren
2.5 Replikationzyklus der Filoviren 13
3. Ziele des Forschungsvorhabens 14
4. Methoden 14
4.1 Herstellung von Filovirusstocks 14
4.1.1 Kultivierung von Vero-Zellen zur Anzucht von Filoviren
4.1.2 Anzucht von Filoviren 15
4.1.3 Anreicherung von Viruspartikeln durch Ultrazentrifugation 15
4.1.4 Nachweis der Infektiosität 15
4.2 Molekularbiologische Methoden 16
4.3 Westernblot-Analyse 16
4.4 Immunfluoreszenz-Analyse 17
5. Ergebnisse 18
5.1 Inaktivierung von Ebola-Virus 18
5.1.1 Kinetik der Virusinaktivierung mit 1 % Nonidet 40,
Triton X-100 und SDS 18
5.1.2 Zytotoxizität der eingesetzten Detergenzien für Vero-Zellen 19
5.1.3 Etablierung einer Filtertechnik zur Verminderung der Zytotoxizität 19
5.1.4 Auswirkung der Filtertechnik auf die Viruskonzentration 20
5.1.5 Inaktivierung von Ebola-Virus mit 0,01 % Nonidet 40,
Triton X-100 und SDS 21
5.1.6 Inaktivierung von Ebola-Virus mit 0,1% Nonidet 40,
Triton X-100 und SDS 22
5.1.7 Inaktivierung von Ebola-Virus mit 1% Nonidet 40,
Triton X-100 und SDS 22
5.1.8 Inaktivierung von Ebola-Virus mittels Paraformaldehyd 23
5.1.9 Inaktivierung von Ebola-Virus mittels ß-Propiolacton 24
5.1.10 Inaktivierung von Ebola-Virus mittels MicroChem Plus 25
5.1.11 Inaktivierung von Ebola-Virus mittels Hitze 26
5.2 Inaktivierung von Marburg-Virus 27
5.2.1 Etablierung der Filtertechnologie für Marburg-Virus 27
-6-
5.2.2 Inaktivierung von Marburg-Virus mittels Detergenzien 27
5.2.3 Inaktivierung von Marburg-Virus mittels ß-Propiolacton 28
5.2.4 Inaktivierung von Marburg-Virus mittels Hitze 30
5.3 Etablierung von monoklonalen Antikörpern gegen Marburg-Virus 30
5.3.1 Reinigung und Gammabestrahlung einer Marburg-Virus
Präparation unter BSL-4 Bedingungen 30
5.3.2 Immunisierung von BalbC-Mäusen und Fusion der Milzzellen 30
5.3.3 Charakterisierung der Zellkulturüberstände
von Primärhybridomzellen 31
5.3.4 Westernblot- und Immunfluoreszenzanalysen von zehn
ausgewählten Hybridomzellüberständen 32
5.3.5 Untersuchung der Überstände von kultivierten Milzzellen
von mit MARV immunisierten Mäusen 34
6. Zusammenfassung und Ausblick 37
7. Referenzliste 38
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