Noroviren und Sapoviren bei landwirtschaftlichen Nutztieren:
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| Format: | Thesis/Dissertation Book |
| Language: | German |
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Giessen
VVB Laufersweiler
2008
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| adam_text | Titel: Noroviren und Sapoviren bei landwirtschaftlichen Nutztieren
Autor: Bank-Wolf, Barbara Regina
Jahr: 2008
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
I
V
VI
VIII
2.1
2.1.1
2.1.2
2.1.2.1
2.1.2.2
2.2
2.2.1
2.2.2
2.2.3
2.2.4
2.3
2.3.1
2.3.2
2.3.2.1
2.3.2.2
2.3.3
2.4
2.5
2.5.1
2.5.2
2.6
2.6.1
2.6.2
2.6.3
2.6.3.1
2.6.3.2
2.6.4
2.6.4.1
2.6.4.2
2.6.5
2.7
2.7.1
2.7.2
2.7.2.1
2.7.2.2
2.7.2.3
2.8
2.8.1
2.8.2
2.8.3
2.8.3.1
2.8.3.2
2.8.3.2.1
2.8.3.2.2
2.8.3.2.3
2.8.4
Einleitung und Zielsetzung.....................................................................................1
Literaturübersicht...................................................................................................2
Taxonomie und Phylogenie von Caliciviren.........................................................................2
Taxonomie...........................................................................................................................2
Phylogenie...........................................................................................................................3
Genus Norovirus..................................................................................................................3
Genus Sapovirus.................................................................................................................3
Geschichte von Nora- und Sapoviren sowie der durch sie induzierten Erkrankungen.......5
Humane Noroviren...............................................................................................................5
Animale Noroviren...............................................................................................................6
Humane Sapoviren..............................................................................................................7
Animale Sapoviren...............................................................................................................8
Morphologie und Molekularbiologie von Nora- und Sapoviren............................................9
Morphologie.........................................................................................................................9
Molekularbiologie...............................................................................................................10
Genomorganisation der Noroviren.....................................................................................12
Genomorganisation der Sapoviren....................................................................................13
Rekombination...................................................................................................................14
Übertragungswege.............................................................................................................14
Immunität gegenüber Nora- und Sapovirusinfektionen.....................................................16
Antikörper...........................................................................................................................16
Genetische Faktoren..........................................................................................................17
Diagnostik von Nora- und Sapovirusinfektionen................................................................17
Klinisches Bild....................................................................................................................17
Transmissionselektronenmikroskopie (TEM).....................................................................18
Zellkultursysteme...............................................................................................................18
Noroviren...........................................................................................................................18
Sapoviren...........................................................................................................................18
Enzyme-Iinked immunosorbent assay (ELISA).................................................................19
Antigen-ELISA...................................................................................................................19
Antikörper-ELISA...............................................................................................................20
Reverse Transkription-Polymerasekettenreaktion.............................................................20
Epidemiologische Studien.................................................................................................22
Humane Nora- und Sapoviren...........................................................................................22
Animale Noro- und Sapoviren............................................................................................22
Bovines Norovirus..............................................................................................................24
Porzines Norovirus.............................................................................................................24
Porzines enterales Sapovirus............................................................................................25
Prävention und Bekämpfung.............................................................................................25
Symptomatische Therapie.................................................................................................25
Prophylaxe.........................................................................................................................25
Impfung..............................................................................................................................26
Art der Impfstoffe, Zielgruppen..........................................................................................26
Impfversuche.....................................................................................................................26
Maus...............................................................................................................................26
Kalb.................................................................................................................................27
Mensch...........................................................................................................................27
Desinfektion.......................................................................................................................27
I
Inhaltsverzeichnis
2.9 Noro- und Sapoviren als Zoonoseerreger?.......................................................................28
2.9.1 Virusnachweis/Rekombination...........................................................................................28
2.9.2 Antikörpernachweis............................................................................................................28
3 Material und Methoden.........................................................................................30
3.1 Material..............................................................................................................................30
3.1.1 Zellen..................................................................................................................................30
3.1.2 Viren und Antikörper..........................................................................................................30
3.1.3 Probenmaterial...................................................................................................................31
3.1.3.1 Probenentnahme................................................................................................................31
3.1.3.2 Herkunft des Probenmaterials...........................................................................................31
3.1.3.3 Fragebogen........................................................................................................................32
3.1.3.4 Statistische Auswertung.....................................................................................................33
3.1.4 Enzyme und Enzympuffer..................................................................................................34
3.1.5 Vorgefertigte Medien und Systeme ( Kits )........................................................................34
3.1.6 Chemikalien und Reagenzien............................................................................................34
3.1.7 Allgemeine Medien und Puffer...........................................................................................35
3.1.8 Medien und Puffer für Zellkultur.........................................................................................35
3.1.9 Puffer für reverse Transkription und Polymerase-Kettenreaktion......................................35
3.1.10 Lösungen für DNS-Klonierung...........................................................................................36
3.1.11 Lösungen für Sequenzgele................................................................................................36
3.1.12 Lösungen und Puffer für SDS-PAGE und PAGE-Färbung................................................36
3.1.13 Lösungen und Puffer für VLP-Reinigung...........................................................................37
3.1.14 Verbrauchsmaterialien.......................................................................................................37
3.1.15 Geräte................................................................................................................................37
3.1.16 Genbank-Zugangsnummern..............................................................................................38
3.1.16.1 Norovirus............................................................................................................................38
3.1.16.2 Sapovirus...........................................................................................................................41
3.1.16.3 Weitere Caliciviren.............................................................................................................43
3.2 Methoden...........................................................................................................................44
3.2.1 Zellkulturtechniken.............................................................................................................44
3.2.1.1 Insektenzellen (SF-21).......................................................................................................44
3.2.1.2 Säugerzellen......................................................................................................................44
3.2.1.3 Bestimmung der Zellzahl...................................................................................................44
3.2.1.4 Infektion von bovinen, ovinen und SF21-Zellen.................................................................45
3.2.1.5 Kryokonservierung von Zellen...........................................................................................46
3.2.2 Reverse Transkription-Polymerasekettenreaktion.............................................................46
3.2.2.1 Aufarbeitung von Kotproben für die RNS-Präparation.......................................................46
3.2.2.2 Aufarbeitung von Organproben für die RNS-Präparation..................................................46
3.2.2.3 RNS-Präparation................................................................................................................46
3.2.2.4 DNS-Extraktion..................................................................................................................47
3.2.2.5 Reverse Transkription........................................................................................................47
3.2.2.6 Polymerasekettenreaktion (PCR)......................................................................................48
3.2.2.7 Auswahl der Primer............................................................................................................48
3.2.2.8 RT-PCR-Protokolle..........................................................................................................49
3.2.2.8.1 RT-PCR..........................................................................................................................49
3.2.2.8.1.1 Norovirus RT-PCR (Teil des Polymerasegens)..............................................................49
3.2.2.8.1.2 Norovirus RT-PCR (Teil des Kapsidgens)......................................................................50
3.2.2.8.1.3 Sapovirus RT-PCR (Teil des Polymerasegens).............................................................50
3.2.2.8.1.4 Sapovirus RT-PCR (Teil des Kapsidgens).....................................................................50
3.2.2.8.2 „One Step RT-PCR.............................................................................................50
3.2.2.8.3 DNS-PCR (Standard-Protokoll)......................................................................................51
3.2.2.9 Analyse der PCR-Produkte................................................................................................52
3.2.2.10 Isolierung von DNS-Fragmenten aus Agarosegelen.........................................................52
3.2.3 Klonierung von DNS-Fragmenten........................................................................53
3.2.3.1 Ligation...............................................................................................................................53
3.2.3.2 Transformation...................................................................................................................54
3.2.3.3 Minipräparation von Plasmid-DNS.....................................................................................55
3.2.3.4 Spaltung mit Restriktionsenzymen.....................................................................................55
3.2.4 DNS-Sequenzierung.....................................................................................56
3.2.4.1 Sequenz-PCR........................................ .......56
Inhaltsverzeichnis
3.2.4.2 Elektrophorese in denaturierenden Harnstoff-Polyacrylamidgelen...................................57
3.2.4.3 Auswertung der Sequenzdaten.........................................................................................58
3.2.5 Phylogenetische Analysen.................................................................................................58
3.2.6 Elektronenmikroskopie.......................................................................................................58
3.2.6.1 Vorbereitung von Kot- und Organproben für die Elektronenmikroskopie..........................58
3.2.6.2 Untersuchung von Probennetzchen im Elektronenmikroskop...........................................59
3.2.6.3 Immunelektronenmikroskopie............................................................................................59
3.2.6.4 Präparation von Ultradünnschnitten für die Elektronenmikroskopie..................................60
3.2.7 Herstellung von rekombinanten virusähnlichen Partikeln (VLPs) mit Hilfe des
Baculovirus-Expressionssystems......................................................................................60
3.2.7.1 Gewinnung von Sequenzdaten des gesamten VP1 und VP2...........................................60
3.2.7.2 Vektor pBlueBacHis2A (Fa. Invitrogen).............................................................................61
3.2.7.2.1 Herstellung der gewünschten Inserts.............................................................................61
3.2.7.2.1.1 Restriktionsverdau..........................................................................................................62
3.2.7.2.1.2 Ligation...........................................................................................................................62
3.2.7.2.1.3 Transformation................................................................................................................62
3.2.7.2.1.4 Minipräparation von Plasmid-DNS.................................................................................63
3.2.7.3 Transfektion von Insektenzellen........................................................................................63
3.2.7.4 Plaque-Reinigung des Transfektions-Virusstocks.............................................................64
3.2.7.4.1 Plaque-Test....................................................................................................................64
3.2.7.4.2 Vermehrung rekombinanter Plaques..............................................................................64
3.2.7.4.3 Analyse der vermehrten Plaques...................................................................................65
3.2.7.4.4 Zweite Piaquereinigung..................................................................................................65
3.2.7.5 Western Blot (Semi Dry-Verfahren)...................................................................................65
3.2.7.6 Coomassie-Färbung von Proteinen...................................................................................67
3.2.7.7 Herstellung von virusähnlichen Partikeln (VLPs)...............................................................68
3.2.7.7.1 Gradientenreinigung von VLPs.......................................................................................68
3.2.7.7.2 Proteinbestimmung.........................................................................................................68
4 Ergebnisse...........................................................................................................69
4.1 Detektion und Analyse von Noroviren...............................................................................70
4.1.1 Nachweis von Norovirus RNS mit Hilfe der RT-PCR........................................................70
4.1.1.1 Polymerasegen..................................................................................................................70
4.1.1.2 Kapsidgen..........................................................................................................................71
4.1.2 Phylogenetische Analysen.................................................................................................75
4.1.2.1 Ermittlung von Nukleinsäureteilsequenzen.......................................................................75
4.1.2.2 Phylogenetische Analysen der Sequenzen aus dem Bereich der RNS-abhängigen
RNS-Polymerase (RdRp)..................................................................................................77
4.1.2.3 Phylogenetische Analysen der Sequenzen aus dem Bereich des Kapsidgens (VP1)......78
4.1.2.4 Häufigkeitsverteilungen der Distanzen von Noroviren in Teilbereichen der für die RNS-
abhängige RNS-Polymerase und der für das Kapsid kodierenden Genombereiche........82
4.1.2.5 Analyse nicht noroviraler Sequenzen................................................................................84
4.1.3 Immunelektronenmikroskopischer Nachweis von Noroviren.............................................85
4.1.4 Infektion boviner und oviner Zellen....................................................................................86
4.1.5 Statistische Auswertung....................................................................................................87
4.1.5.1 Eingesandte Kot- und Organproben von Rindern.............................................................87
4.1.5.1.1 Jahreszeitliche Verteilung...............................................................................................87
4.1.5.1.2 Alter/Rasse/Geschlecht/Herkunft................................................................................88
4.1.5.1.3 Symptome Einzeltier.......................................................................................................90
4.1.5.1.4 Angaben zum Bestand...................................................................................................92
4.1.5.2 Fragebogenaktion Rind.....................................................................................................92
4.1.5.2.1 Jahreszeitliche Verteilung...............................................................................................92
4.1.5.2.2 Alter/Rasse/Geschlecht/Herkunft................................................................................93
4.1.5.2.3 Betriebsform/Bestandsprobleme....................................................................................94
4.1.5.2.4 Symptome der Einzeltiere..............................................................................................95
4.1.5.3 Zusammenfassung der statistischen Ergebnisse..............................................................96
4.2 Detektion und Analyse von Sapoviren...............................................................................98
4.2.1 Nachweis von Sapovirus RNS mit Hilfe der RT-PCR........................................................98
4.2.1.1 Polymerasegen..................................................................................................................98
4.2.1.2 Kapsidgen..........................................................................................................................98
4.2.2 Phylogenetische Analysen...............................................................................................102
III
Inhaltsverzeichnis
4.2.2.1 Ermittlung von Nukleinsäureteilsequenzen......................................................................102
4.2.2.2 Phylogenetische Analysen im Bereich der RNS-abhängigen RNS-Polymerase (RdRp) 103
4.2.2.3 Phylogenetische Analysen im Bereich des Kapsidgens (VP1)........................................103
4.2.2.4 Phylogenetische Analysen im Bereich des RdRp-VP1 Übergangsbereiches.................103
4.2.2.5 Häufigkeitsverteilungen der Distanzen von Sapoviren in Teilbereichen der für die RNS-
abhängige RNS-Polymerase und der für das Kapsid kodierenden Genombereiche......106
4.2.2.6 Analyse nicht sapoviraler Sequenzen..............................................................................108
4.2.3 Immunelektronenmikroskopischer Nachweis von Sapoviren..........................................109
4.2.4 Statistische Auswertung...................................................................................................109
4.2.4.1 Fragebogenaktion Schwein.............................................................................................109
4.2.4.1.1 Jahreszeitliche Verteilung.............................................................................................110
4.2.4.1.2 Betriebsform/Bestandsprobleme..................................................................................111
4.2.4.1.3 Symptome Einzeltier.....................................................................................................112
4.2.4.2 Zusammenfassung der statistischen Untersuchung........................................................113
4.3 Produktion von virusähnlichen Partikeln (VLPs)..............................................................114
4.3.1 Expression des Strukturproteins VP1 des porzinen enteralen Sapovirus (Stamm PEC
Cowden)...........................................................................................................................114
4.3.1.1 Produktion von VLPs........................................................................................................114
4.3.1.2 Nachweis der Expression des VP1..................................................................................115
4.3.1.3 Produktion von PEC-VLPs...............................................................................................116
4.3.2 Co-Expression der Strukturproteine VP1 und VP2 von Noroviren sowie Sapoviren mit
Hilfe rekombinanter Baculoviren......................................................................................119
4.3.2.1 Grundlagen und Prinzipien der Expression.....................................................................119
4.3.2.2 Porzines enterales Sapovirus (rM25)...............................................................................124
4.3.2.2.1 Nachweis der Expression des Kapsidproteins VP1......................................................124
4.3.2.2.2 Produktion von porzinen enteralen Sapovirus-VLPs....................................................125
4.3.2.3 Bovines Norovirus (r18161).............................................................................................127
4.3.2.3.1 Nachweis der Expression des Kapsidproteins VP1......................................................127
4.3.2.3.2 Produktion von bovinen Norovirus-VLPs......................................................................127
4.3.3 Zusammenfassung: Produktion von VLPs.......................................................................129
5 Diskussion..........................................................................................................130
5.1 Reverse Transkription-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR)..........................................131
5.2 Nachweis von Noroviren bei landwirtschaftlichen Nutztieren..........................................133
5.3 Nachweis von Sapoviren bei landwirtschaftlichen Nutztieren.........................................135
5.4 Phylogenetische Analysen der detektierten Nora- und Sapovirusisolate........................137
5.4.1 Norovirus..........................................................................................................................137
5.4.2 Sapovirus.........................................................................................................................139
5.4.3 Statistische Zuverlässigkeit der phylogenetischen Bäume..............................................140
5.4.4 Genetische Distanzen der für die phylogenetischen Bäume verwendeten Isolate..........140
5.4.5 Rekombination.................................................................................................................141
5.5 Produktion virusähnlicher Partikel (VLPs) und deren Einsatz für die Diagnostik............142
5.6 Bedeutung animaler Nora- und Sapoviren als Infektionserreger für landwirtschaftliche
Nutztiere...........................................................................................................................145
5.7 Bedeutung animaler Noro- und Sapoviren als Infektionserreger für den Menschen.......146
6 Zusammenfassung.............................................................................................148
7 Summary............................................................................................................150
8 Literaturverzeichnis............................................................................................152
9 Anhang...............................................................................................................168
9.1 Rohdaten der untersuchten Kot- und Organproben........................................................168
9.1.1 Rohdaten Rind - eingesandte Proben.............................................................................169
9.1.2 Rohdaten Rind - Fragebogenaktion.................................................................................196
9.1.3 Rohdaten Schwein...........................................................................................................204
IV
Tabellenverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Taxonomie der Familie Caliciviridae.....................................................................2
Tab. 2: Seroprävalenz boviner und porziner Noro- und Sapoviren.................................22
Tab. 3: Virus-Prävalenz boviner und porziner Noro- und Sapoviren...............................24
Tab. 4: Auflistung der gesammelten Proben nach Tierarten..........................................31
Tab. 5: Genbankzugangsnummern von Vertretern des Genus Norovirus......................41
Tab. 6: Genbankzugangsnummern von Vertretern des Genus Sapovirus.....................43
Tab. 7: Genbankzugangsnummern von Vertretern der Genera Vesivirus, Lagovirus
und nicht klassifizierten Genus innerhalb der Familie Caliciviridae....................43
Tab. 8: Primer zur Detektion von Noro- und Sapoviren..................................................49
Tab. 9: Standard-Protokoll für RT-PCR..........................................................................49
Tab. 10: Protokoll der „One Step RT-PCR® (Fa. Qiagen)...............................................51
Tab. 11: Standardprotokoll für DNS-PCR.........................................................................51
Tab. 12: Mix für Ligation mit dem TOPO TA Cloning® Kit (Fa. Invitrogen).......................54
Tab. 13: Zusammensetzung der Ansätze für einen Restriktionsverdau...........................56
Tab. 14: Protokoll der Sequenz-PCR mit den Primern M13IR und M13IRrev..................57
Tab. 15: Herstellung von cDNA mit einem oligoDT-21 Primer.........................................60
Tab. 16: Primer zur Sequenzierung des VP1 und VP2 von bovinen Noroviren sowie
porzinen enteralen Sapoviren.............................................................................61
Tab. 17: Primer mit Schnittstellen zur Klonierung in Baculovirus Transfervektor
pBlueBacHis2A® (5 -3 )......................................................................................61
Tab. 18: Ansatz für Restriktionsverdau zur Klonierung in den Vektor pBlueBacHis2A®
(Fa. Invitrogen)...................................................................................................62
Tab. 19: Ligationsmix........................................................................................................62
Tab. 20: Zusammensetzung Transfektionsmix.................................................................63
Tab. 21: Ergebnisse der mit Hilfe der Primer JV12Y/13I (Vennema et al., 2002) auf
Norovirus RNS untersuchten Proben nach Tierarten.........................................70
Tab. 22: Auflistung der in der Norovirus RT-PCR positiven Proben von Rindern............74
Tab. 23: Genbank-Zugangsnummern Norovirusisolate....................................................77
Tab. 24: Auflistung der in der RT-PCR (Primerpaare JV12Y/13I, NoV-Bac-01F/02R)
falsch positiven Proben.......................................................................................85
Tab. 25: Zusammenfassung der statistischen Ergebnisse der Proben von Rindern........97
Tab. 26: Ergebnisse mit Hilfe der Primer JV33/SR80(+) (Vinje et al., 2000a) auf
Sapovirus RNS untersuchten Proben nach Tierarten.........................................98
Tab. 27: Proben von Schweinen, untersucht mit dem PEC-spezifischen Primerpaar
PEC-02R/03F.....................................................................................................98
Tab. 28: Auflistung der in der Sapovirus RT-PCR (Primer SR80(+)/JV33 und/oder
PEC-03F/02R) positiven Proben von Schweinen.............................................101
Tab. 29: Genbank-Zugangsnummern Sapovirusisolate.................................................102
Tab. 30: Auflistung der in der RT-PCR (Primerpaare SR80(+)/JV33, PEC-03F/02R)
falsch positiven Proben.....................................................................................108
Tab. 31: Zusammenfassung der statistischen Ergebnisse der Fragebogenaktion
Schwein............................................................................................................113
Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Phylogenetischer Baum der Familie Caliciviridae....................................................4
Abb. 2: Elektronenmikroskopisches Bild von Caliciviren......................................................9
Abb. 3: Norwalk-Virus Kapsid als Beispiel für das VP1 von Caliciviren..............................10
Abb. 4: Genomorganisation und Spaltprodukte des ORF1 von Noroviren.........................12
Abb. 5: Genomorganisation und Spaltprodukte des ORF1 von Sapoviren........................13
Abb. 6: Übertragungswege für Calicivirusinfektionen beim Menschen und bei
landwirtschaftlichen Nutztieren..............................................................................15
Abb. 7: Geographische Verteilung der Herkunft der in dieser Arbeit untersuchten Kot-
und Organproben...................................................................................................32
Abb. 8: Fragebogen bei Probennahme..............................................................................33
Abb. 9: Transfektion von Insektenzellen, Piaquereinigung und Produktion hochtitriger
Virusstocks.............................................................................................................66
Abb. 10: PCR zum Nachweis von Norovirus RNS. Lokalisation der Primerpaare
JV12Y/13I sowie NoV-Bac-01F/02R......................................................................72
Abb. 11: Agarosegel der PCR-Produkte sowie der Minipräparationen nach
Kontrollverdau........................................................................................................75
Abb. 12: Phylogenetischer Baum von Vertretern des Genus Norovirus auf der Basis
von 250 Basen des RdRp Gens.............................................................................79
Abb. 13: Ausschnittsvergrößerung der Genogruppe III der Noroviren aus Abb. 12.............80
Abb. 14: Phylogenetischer Baum von Vertretern des Genus Norovirus auf der Basis
von 739 Basen des Kapsidgens.............................................................................81
Abb. 15: Häufigkeitsverteilungen der Divergenzen von Norovirus-Sequenzen...................83
Abb. 16: Immunelektronenmikroskopischer Nachweis von Noroviruspartikeln....................86
Abb. 17: Probenverteilung der eingesandten Proben von Rindern nach Jahreszeiten
sowie positivem Norovirusgenomnachweis.........................................................88
Abb. 18: Altersverteilung der eingesandten Proben von Rindern (Alter in Monaten)...........89
Abb. 19: Symptomgruppen/Organsysteme, die bei den beprobten Tieren
vorlagen/betroffen waren (eingesandte Proben)....................................................90
Abb. 20: Elektronenmikroskopischer Nachweis von Rota- und Coronaviren im Hinblick
auf die Gesamtprobenzahl sowie das gleichzeitige Auftreten von
Norovirusinfektionen..............................................................................................91
Abb. 21: Pathologisch-anatomische Diagnosen..................................................................91
Abb. 22: Jahreszeitliche Verteilung der Proben von Rindern (Fragebogenaktion) und
des positiven Norovirusgenomnachweises............................................................92
Abb. 23: Altersverteilung der Proben von Rindern der Fragebogenaktion...........................93
Abb. 24: Bestandsprobleme in den im Rahmen der Fragebogenaktion beprobten
Beständen..............................................................................................................95
Abb. 25: Symptomgruppen/Organsysteme, die bei den beprobten Tieren
vorlagen/betroffen waren.......................................................................................96
Abb. 26: RT-PCR zum Nachweis von Sapovirus RNS. Lokalisation der Primerpaare
JV33/SR80(+) sowie Pec-02R/03F im Sapovirus Genom....................................100
Abb. 27: Phylogenetischer Baum von Vertretern des Genus Sapovirus auf der Basis
von 228 Basen der RdRp.....................................................................................104
Abb. 28: Phylogenetischer Baum von Vertretern des Genus Sapovirus auf der Basis
von 351 Basen des Kapsidgens...........................................................................105
Abb. 29: Häufigkeitsverteilungen der Divergenzen von Sapovirus-Sequenzen.................107
Abb. 30: Immunelektronenmikroskopischer Nachweis von Sapoviruspartikeln in einer
Kotprobe eines infizierten Schweines..................................................................109
Abb. 31: Probenverteilung der eingesandten Proben von Schweinen nach Jahreszeiten
sowie positivem Sapovirusgenomnachweis.........................................................110
Abb. 32: Altersverteilung der Proben von Schweinen........................................................111
Abb. 33: Symptome der Einzeltiere (Schweine).................................................................112
Abb. 34: Mikroskopisches Bild von SF-21 Zellen...............................................................115
Abb. 35: Immunfluoreszenz an SF21 Zellen......................................................................116
VI
Abbbildungsverzeichnis
Abb. 36: Elektronenmikroskopische Bilder von Baculoviren und eines PEC-VLPs............117
Abb. 37: Elektronenmikroskopisches Bild von SF21-Zellen...............................................118
Abb. 38: Schematische Darstellung der Stabilisierung von VLPs durch VP2 nach
Bertolotti-Ciarlet....................................................................................................119
Abb. 39: Klonierung von VP1 und VP2 von Noro- und Sapoviren in den Baculovirus
Transfervektor pBlueBacHis2A®...........................................................................121
Abb. 40: Vorgehen zur Klonierung des gewünschten Fragmentes in den
BaculovirusexpressionsvektorpBlueBacHis2A®...................................................122
Abb. 41: Identifizierung rekombinanter rM25-Plaques........................................................123
Abb. 42 : Western Blot von rM25 (porzine enterale Sapovirus VLPs)................................125
Abb. 43: A) Coomassie-Färbung und B) Western Blot einzelner Fraktionen der
Gradientenreinigung von rM25.............................................................................126
Abb. 44: Western Blot von Überstand von r18161P10 und r18161P12.............................127
Abb. 45: Coomassie-Färbung und Western Blot einzelner Fraktionen der
Gradientenreinigung von r18161..........................................................................128
Abb. 46: Elektronenmikroskopisches Bild von Norovirus-VLPs (Negativkontrastierung). .129
VII
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