Parakrine Interaktionen von Hepatozyten und hepatischen Sternzellen im Rahmen der experimentellen Leberfibrogenese:
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| Format: | Hochschulschrift/Dissertation Buch |
| Sprache: | Deutsch |
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2007
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Abkürzungen IX
1 Einleitung 1
1.1 Definition 1
1.2 Histologie und Histopathologie 4
1.3 Komponente I: Hepatische Sternzelle und Myofibroblast 8
1.4 Komponente II: Die Matrix 12
1.5 Komponente III: Mediatoren, Rezeptoren und Downstream-Regulation 17
1.6 Klinik und Therapieansatz 21
1.7 Forschungsansatz der Arbeit 24
2 Material und Methoden 26
2.1 Zellpäparationen 26
2.2 Kultivierung und Mediengewinnung 31
2.3 Bestimmung wichtiger Parameter 35
2.4 RNA/RNA in situ Hybridisierung 51
2.5 Chromatographien 62
2.6 Enzymatische und chemische Spaltungen 73
2.7 Allgemeine Hinweise und Statistik 80
3 Ergebnisse 82
3.1 Gewinnung von Hepatozyten-konditionierten Medien unter schädigenden
und protektiven Einflüssen 82
3.2 Isolierung eines die HSC-Proliferation inhibierenden Faktors aus Hepato
zyten-konditioniertem Medium 103
3.3 Analytik zur Identifizierung des Faktors 123
3.4 Untersuchungen zum Wirkungscharakter des Faktors 144
4 Diskussion 159
4.1 Stimulator oder Inhibitor? 159
4.2 Isolierung, Analyse, Wirkung und Vergleich des Faktors mit bereits
beschriebenen Faktoren 165
4.3 Ausblick mit modifiziertem Versuchsaufbau zur Identifizierung des Inhibi
tors anhand der hier gewonnenen Erkenntnisse 204
5 Zusammenfassung 214
Anhang 218
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungen IX
1 Einleitung 1
1.1 Definition 1
1.1.1 Einordnung in den Formenkreis der fibroproliferativen Funktions
Störungen 1
1.1.2 Atiologie 3
1.1.3 Morbidität und Mortalität 3
1.2 Histologie und Histopathologie 4
1.2.1 Histologie der gesunden Leber 4
1.2.2 Schädigungskaskade und Wundheilung 5
1.2.2.1 Schädigung 5
1.2.2.2 Inflammation 6
1.2.2.3 Zellproliferation (Regeneration) 6
1.2.2.4 Produktion von extrazellulärer Matrix (Remodeling) 7
1.3 Komponente I. Hepatische Sternzelle und Myofibroblast 8
1.3.1 Hepatische Sternzelle 8
1.3.1.1 Zytologie/Heterogenität 8
1.3.1.2 Funktion 9
1.3.1.3 Aktivierung, Transdifferenzierung und Verhalten der hepatischen
Sternzelle in vivo und in vitro 10
1.3.2 Myofibroblast 10
1.3.3 Apoptose 11
1.4 Komponente II Die Matrix 12
1.4.1 Matrixkomponenten mit biologischer Aktivität 13
1.4.2 Matrix-Zeil Interaktionen 14
1.4.3 Zeil-Matrix Interaktionen 14
1.4.3.1 Reverses Remodeling 14
1.4.3.2 Remodeling 15
1.4.4 Modulation von Faktoren und Enzymen 16
1.5 Komponente III: Mediatoren, Rezeptoren und Downstream-Regulation 17
1.5.1 Transforming Growth Factor-ß 17
1.5.2 Plateled derived Growth Factor 19
1.5.3 Vasoaktive Peptide 19
1.5.4 Adipokine 20
1.5.5 NO, ROS und reaktive Aldehyde 20
II
Inhaltsverzeichnis
1 6 Klinik und Therapieansatz 21
1.6.1 Krankheitsverlauf und Prognose 21
1.6.2 Therapieansätze 22
1.6.2.1 Unterdrückung der Inflammation 22
1.6.2.2 Down-Regulation der hepatischen Sternzelle 22
1.6.2.3 Förderung der Matrixdegradation 23
1.6.2.4 Gentherapie: 23
1.6.2.5 Stammzelltherapie 23
1 7 Forschungsansatz der Arbeit 24
2 Material und Methoden 26
2.1 Zellpaparationen 26
2.1.1 Versuchstier, Material und Lösungen 26
2.1.2 Parenchymzellen 28
2.1.3 Hepatische Sternzellen (Fettspeicherzellen) 29
2.1.4 Fibroblasten 30
2.1.5 HepG2 Zellen 30
2.1.6 Myofibroblasten 30
2.2 Kultivierung und Mediengewinnung 31
2.2.1 Medien und Materialien 31
2.2.1.1 Zytotoxische Substanzen 31
2.2.1.2 Zytoprotektive Substanzen 31
2.2.1.3 Radioaktive Marker 32
2.2.2 Primärkultivierung und Mediumgewinnung 32
2.2.2.1 Hepatozytenkultivierung 32
2.2.2.2 Mediumgewinnung unter zytotoxischen und zytoprotektiven
Bedingungen 32
2.2.2.3 Mediumgewinnung für die Faktorisolation 33
2.2.2.4 Mediumgewinnung aus [35S]-Sufat und [3H]-Leucin markierten
Hepatozytenkulturen 33
2.2.2.5 Kultivierung von hepatischen Sternzellen 34
2.3 Bestimmung wichtiger Parameter 35
2.3.1 Proteinbestimmungen 35
2.3.1.1 Comassie-Proteinassay 35
2.3.1.2 BCA-Proteinassay 36
2.3.2 Laktatdehydrogenase (LDH), Aspartataminotransferase (AST)
Alaninaminotransferase (ALT) 36
2.3.3 Arginase-Assay 37
III
Inhaltsverzeichnis
2.3.4 Proteasen-Assay 38
2.3.5 Uronsäure-Assay 39
2 3.6 Aldanblaupräzipitations-Assay 40
2.3.7 Antikoagulations-Assay 41
2.3.8 Proliferationsassays 43
2.3.8.1 Messung der [3H]-Thymidineinbaurate 43
2.3.8.2 Fluorometrische DNA-Bestimmung 44
2.3.8.3 Optische Darstellung des Bromodesoxyuridineinbaus 45
2.3.9 Messung der Gesamtproteinsynthese 47
2.3.10 Zellviabilitätsbestimmungen 48
2.3.10.1 Trypanblau 48
2.3.10.2 Propidiumjodid 48
2.3.11 Reinheitsprüfung von HSC-Kulturen 49
2.3.11.1 Mikroskopie und Autofluoreszenz 49
2.3.11.2 Indirekte Immunperoxidasefärbung von Vimentin und Desmin 49
2.3.12 Transdifferenzierungsassay 50
2.4 RNA/RNA in situ Hybridisierung 51
2.4.1 Lösungen 51
2.4 1.1 RNase freie Lösungen 51
2.4.1.2 Lösungen, die nicht RNase-frei sein müssen 52
2.4.1.3 Präparation der Plasmide 53
2.4.2 Herstellung der Sonden 54
2.4.2.1 Linearisieren der Plasmide 54
2.4.2.2 Minigel (0,8 % Agarose) 55
2.4.2.3 Transkription mit [35S]-UTP 56
2.4.2.4 Bestimmung des [35S]-UTP-Einbaus in die Transkripte 57
2.4.2.5 Phenol-Extraktion: 57
2.4.2.6 Alkalische Hydrolyse 57
2.4.3 In situ Hybridisierung 58
2.4.3.1 Vorbereitung der Monozellayerkulturen 58
2.4.3.2 Hybridisierung 59
2.4.3.3 Waschen nach Hybridisierung 60
2.4.4 Beschichten der Zellayer mit Fotoemulsion und Entwicklung 61
2.5 Chromatographien 62
2.5.1 lonenaustausch-Chromatographie 62
2.5.1.1 S-Sepharose ff Kationenaustausch-Chromatographie 63
2.5.1.2 DEAE-SephacelAnionenaustausch-Chromatographie 64
IV
Inhaltsverzeichnis
2.5.13 Einsatz von DEAE 5 und 6 nach Dialyse In dissoziierenden
Puffern 65
2.5.2 Ausschlusschromatographie 66
2.5.2 1 Superdex200 67
2.5.2.2 Sepharose-CL 6B 68
2.5.3 HPLC Ausschlusschromatographie 70
2.5.3.1 TSKG2000SW 70
2.5.3.2 TSKG3000SW 71
2.5.4 Heparin-Sepharose Affinitätschromatographie 72
2.6 Enzymatische und chemische Spaltungen 73
2.6.1 Abbau durch Trypsin 73
2.6.2 p-Eliminierung 74
2.6.3 Abbau des Faktors durch Heparinase l/lll. HNO2 und Chondroiti
naseABC 75
2.6.4 TSK 1 Abbau mit anschließendem Zellkultureinsatz 76
2.6.4.1 Abbau durch Heparinase l/lll 76
2.6.4.2 Abbau durch Heparitinase I mit anschließender Abbaukontrolle 77
2.7 Allgemeine Hinweise und Statistik 80
2.7.1 Zentrifugation 80
2.7.2 Temperatur 80
2.7.3 Sterilität 80
2.7.4 Statistik 80
3 Ergebnisse 82
3.1 Gewinnung von Hepatozyten-konditionierten Medien unter schädigenden und
protektiven Einflüssen 82
3.1.1 Zellsuspension unter hypoxischer N2-Atmosphäre 82
3.1.2 Gewinnung von Hepatozyten-konditionierten Medien unter Einwirkung von
zytotoxischen Substanzen 86
3.1.3 Behandlung von hepatischen Sternzellen mit Hepatozyten-konditioniertem
Medium unter Einwirkung von zytoprotektiven Substanzen 93
3.1.4 Untersuchung von primär kultivierten Hepatozyten auf den
proliferationsfördernden Faktor TGF-alpha 99
3.2 Isolierung eines die HSC-Proliferation inhibierenden Faktors aus Hepatozyten-
konditioniertem Medium 103
3.2.1 Ankonzentration mittels Tangentialfluß Diafiltration 103
3.2.2 S-Sepharose ff Kationenaustausch-Chromatographie von PCcM 104
3.2.2.1 S-Sepharose ff 104
3.2.3 Superdex 200 Chromatographie von S 1 108
V
Inhaltsverzeichnis
3.2.4 DEAE-Sephacel Anionenaustausch-Chromatographie von SD 1 111
3.2.4.1 DEAE Gradient 1 111
3.2.4.2 DEAE Gradient 2 115
3.2.4.3 Dissoziationsversuche unter Harnstoff und Guanidiniumchlond
mit anschließendem Einsatz in Zellkultur 119
3.2.5 TSK G2000 SW Chromatographie von DEAE 5 120
3.3 Analytik zur Identifizierung des Faktors 123
3.3.1 Untersuchung des die HSC-Proliferation inhibierenden Faktors auf
Proteincharakter Sensibilität gegenüber Trypsin 123
3.3.2 Aminosäurenanalyse des proteolysierten Pools DEAE 5 125
3.3.3 Fällung der TSK-Fraktionen mittels Alcianblau-Präzipitation 126
3.3.4 Mittlere Hemmdosis im Verlauf der Aufreinigung 128
3.3.5 Untersuchung des Faktors auf Proteoglykancharakter 128
3.3.5.1 Sepharose-CL 6B Chromatographie von DEAE 5 vor und nach ß-
Eliminierung 130
3.3.5.2 Untersuchung des Faktorsauf Glykosaminoglykanseitenketten:
Heparinase I/III-; HNO2- und Chondroitinase ABC-Abbau 131
3.3.6 Enzymatischer Abbau von TSK 1 mit anschließendem Zellkultureinsatz 132
3.3.6.1 TSK 1 Behandlung mit Heparinase l/Ml 133
3.3.6.2 TSK 1 Abbau durch Heparitinase I, SDS-Page, Heparin-
Sepharose Chromatographie, Heparinfunktionalität 134
3.3.6.3 Bindungsfähigkeit TSK 1/Heparitinase I Pools an Heparin-
Sepharose 139
3.4 Untersuchungen zum Wirkungscharakter des Faktors 144
3.4.1 Spezifität des Faktors auf unterschiedliche Zellpopulationen 144
3.4.2 Reversibilität des Inhibitorischen Effekts des Faktors 147
3.4.3 Einfluß des Inhibitors auf die Vitalität der HSC 149
3.4.4 Einfluß des Inhibitors auf die Gesamtproteinbiosynthese der HSC 149
3.4.5 Einfluß des Inhibitors auf die Transdifferenzierung der HSC zu
Myofibroblasten 150
3.4.6 Wechselwirkung zwischen TSK1 und FKS 150
3.4.6.1 Effekt des Faktors in Anwesenheit unterschiedlicher FKS
Konzentration des Kulturmediums 150
3.4.6.2 Wirkung von TSK 1 auf in FKS nach Elimination der Heparin
bindenden Wachstumsfaktoren ausgesäate HSC 152
3.4.7 Einfluß auf die Proliferation der HSC 154
3.4.7.1 Austestung im Bromodesoxyuridinassay und in der DNA-
Fluorometne 154
VI
Inhaltsverzeichnis
3.4.7.2 Austestung im [3H]-Thymidinproliferationsassay unter
Berücksichtigung des Kompartlments Zytosol 155
4 Diskussion , 159
4.1 Stimulator oder Inhibitor? 159
4.1.1 Wertung der Zellsuspensions- bzw Zytotoxizitäts-Versuche hinsichtlich
Inhibitor versus Stimulator 159
4 1.2 Wertung der zytoprotektiven Versuche hinsichtlich Inhibitor versus
Stimulator 161
4.1.3 Zusammenfassende Bewertung der Untersuchungsergebnisse unter
zytotoxischen/-protektiven Bedingungen 163
4.1.4 Inhibitoren: Parakrine Interakteure im fibrogenetischen Prozess 163
4.1.5 Freisetzung von bekannten Wachstumsinhibitoren durch Hepatozyten . 164
4.2 Isolierung. Analyse, Wirkung und Vergleich des Faktors mit bereits
beschriebenen Faktoren 165
4 2.1 Heparansulfatproteoglykane als parakrine Interakteure der Leberfibro-
genese? 169
4.2.1.1 Heparin und Heparansulfatproteoglykane 171
4.2.1.2 In der Leber exprimierte Heparansulfatproteoglykane 174
4.2.1.3 Vergleich der in der Faktoranalytik erhaltenen Daten mit
Proteindatenbanken 199
4.2.1.4 Mögliche an Heparansulfat assoziierte Inhibitoren: Hepatocyte
Growth Factor (HGF) 200
4.2.2 Wirkungsweise des Inhibitors auf die HSC-Kultur 200
4.2.3 Untersuchung auf artefizielle Wirkungsweisen 201
4.3 Ausblick mit modifiziertem Versuchsaufbau zur Identifizierung des Inhibi
tors anhand der hier gewonnenen Erkenntnisse 204
4.3.1 Zellkultivierung und Mediumgewlnnung 204
4.3.2 Modifikation der Aufreinigung 205
4.3.2.1 Isolation von Proteoglykanen aus dem Hepatozytenproteom 205
4.3.2.2 Auftrennung der Proteoglykane des Hepatozytenproteoms 206
4.3.3 Modifikation der Identifizierung 206
4.3.3.1 Identifizierung des Core-Protetns „Peptid mass fingerprints 206
4.3.3.2 Identifizierung der Zuckerketten „Polysaccharide massf amon
fingerprints 207
4.3.4 Wahl der Methoden zur Untersuchung der Funktionsdomäne des
Inhibitors 208
4.3.5 Wahl der Methoden zur Untersuchung der Wirkung 210
VII
Inhaltsverzeichnis
4.3.5.1 Proteomveränderung durch Einfluß des Inhibitors auf
fibroproliferative Zellen 210
4.3.5.2 Transkriptomveränderung durch Einfluß des Inhibitors auf
fibroproliferative Zellen 210
4.3.5.3 Untersuchungen zur Wirkung des Faktors auf Proliferation.
Migration und Differenzierung fibroproliferativer Zellen 210
4.3.6 Hepatozytenproteom 212
5 Zusammenfassung 214
Anhang 218
I Literaturverzeichnis 218
II Tabellenverzeichnis 271
III Abbildungsverzeichnis 275
VIII
II Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Erkrankungen des fibroproliferativen Formenkreises 2
Tabelle 2: Child-Pugh-Kriterien 21
Tabelle 3: Chromatographieprotokoll der S-Sepharose ff 1,0/5 und 1,5 x 10 cm .. 64
Tabelle 4: Chromatographieprotokoll der DEAE-Sephacel 1,0/5,0 Gradient 1//2.. 65
Tabelle 5: Elutionsvolumen und Kav der Molekulargewichtsmarker der
Superdex 200 Chromato-graphie 16 x 60//26 x 60 67
Tabelle 6 : Elutionsvolumen und Kav der Molekulargewichtsmarker der
Sepharose-CL 6B Chromatographie 69
Tabelle 7: Elutionsvolumen und Kav der Molekulargewichtsmarker der
TSK G2000 SW Chromatographie in PBS-Dulbecco/rTRIS-HCI 70
Tabelle 8: Elutionsvolumen und Kav der Molekulargewichtsmarker der
TSK G3000 SW Chromatographie in PBS - Dulbecco 71
Tabelle 9: Chromatographieprotokoll der Heparin-Sepharose HiTrap 73
Tabelle 10: Abbauprotokoll der TSK 1 Probe durch Heparinasen I und III 77
Tabelle 11: Abbauprotokoll von TSK 1 durch Heparitinase 1 77
Tabelle 12: [3H]-Thymidmeinbauraten und Schädigungsparameter des
Kontroll PCcM 83
Tabelle 13: [3H]-Thymidineinbaurate/Schädigungsparameter unter
N2-Atmosphäre, 84
Tabelle 14: Korrelationskoeffizienten und Signifikanzen: CO2-Atmosphäre (schwarz),
N2-Atmosphäre (blau) 85
Tabelle 15: [3H]-Thymidineinbauraten und Schädigungsparameter des
Kontroll-PCcM 87
Tabelle 16: [3H]-Thymidineinbauraten und Schädigungsparameter des CCCP
behandelten PCcM 88
Tabelle 17: Korrelationskoeffizienten und Signifikanzen: Kontrolle (schwarz), CCCP
(blau) 89
Tabelle 18: [3HJ-Thymidineinbaurate Schädigungseigende Parameter unter
TBHP-PCcM 90
Tabelle 19: [3H]-Thymidineinbaurate/Schädigungsanzeigenden Parameter unter
A23187-PCCM 91
Tabelle 20: Korrelationenskoeffizienten und Signifikanzen: TBHP (schwarz).
A23187(blau) 92
Tabelle 21: Modifikation der PCcM Wirkung auf HSC durch Dexamethason 94
Tabelle 22: Modifikation der PCcM Wirkung auf HSC durch PGE2 95
Tabelle 23 : Modifikation der PCcM Wirkung auf HSC durch PMA 97
271
Tabellenverzeichnis
Tabelle 24: Protein und Arginasemenge des auf die S-Sepharose ff aufgetra
genen PCcM 80/80a/81 104
Tabelle 25 : Fraktionierung und Pooleinteilung der S-Sepharose ff Chromatogra
phie von PCcM 80/80a/81, Proteinmessung und Arginaseaktivität 105
Tabelle 26: [3H]-Thymidineinbau in Gegenwart in Gegenwart von PCcM und
S 1 - 4 der Charge 80/80a/81 105
Tabelle 27 : Fraktionierung und Pooleinteilung der Superdex 200 16/60 Chroma
tographie von SD 1 der Charge 80/80a/81, Proteinmenge und
Arginaseaktivität 108
Tabelle 28 : [3H]-Thymidineinbau in Gegenwart von PCcM/S 1 und SD 1 - 4 der
Charge 80/80a/81 109
Tabelle 29. Protein-, Uronsäuremenge und Arginaseaktivität von PCcM/S 1
und dem auf die DEAE-Sephacel (Gradient 1) aufgetragenen SD 1 .. 111
Tabelle 30: Fraktionierung und Pooleinteilung der DEAE-Sephacel 1,0/5
Anionenaustauscher-Chromatographie von SD 1 Charge 52a/73a/
86-90a, Protein-, Uronsäure-menge und Arginaseaktivität 112
Tabelle 31 : [3H]-Thymidineinbau in HSC-Kulturen in Gegenwart von PCcM, S 1,
SD 1, DEAE 1 - 4 der Charge 52a/73/86 - 90a 113
Tabelle 32 Protein- und Uronsäuremenge von PCcM/S1 94 - 95a und dem auf
die DEAE-Sephacel aufgetragenen SD 1 115
Tabelle 33 : Fraktionierung und Pooleinteilung der DEAE-Sephacel
Anionenaustausch-Chromatographie von SD 1 94 - 95a, sowie
Protein- und Uronsäuremenge 116
Tabelle 34: [3H]-Thymidineinbau in HSC-Kulturen in Gegenwart von PCcM, S 1,
SD 1, DEAE 1 - 6 der Charge 94 - 95a 117
Tabelle 35: [3H]-Thymidineinbau in HSC-Kulturen nach Dialyse des Faktors
unter dissoziativen Puffern 119
Tabelle 36. Proteinmenge von PCcM, S 1, SD 1 und des auf die TSK G2000 SW
aufgetragenen DEAE 5 120
Tabelle 37: TSK G2000 SW HPLC-Chromatographie von DEAE 5 116-118a/120 -
126a, die Proteinmenge von TSK 1-4 wurde entsprechend der
Flächenanteile mittels der aufgetragenen Proteinmenge geschätzt... 121
Tabelle 38: [3H]-Thymidineinbaurate der HSC-Kulturen in Gegenwart der
TSK 1-4 der Charge 116- 118a/120- 126a 122
Tabelle 39: Retentionszeiten der TSK 1 ohne und nach Trypsin-Abbau 124
Tabelle 40: [3H]-Thymidineinbau in HSC-Kulturen in Gegenwart des
trypsinbehandelten DEAE 5 116 - 126a 124
Tabelle 41: Aminosäurenanalyse des Core-Proteins 126
272
Tabellenverzeichnis
Tabelle 42: Proteinmenge von PCcM, S 1, SD 1 und des auf die TSK G2000 SW
aufgetragenen DEAE 5 126
Tabelle 43: Pooleinteilung der Fraktionen (0,2 ml), nach TSK G2000 SW HPLC-
Chromatographie von DEAE 5 128 - 129a/130 - 139a in 10 mM Tris-Cl
und 100 mM NaCI pH 7.0 127
Tabelle 44: Pooleinteilung der Fraktionen (0,2 ml), nach TSK G2000 SW HPLC-
Chromatographie von DEAE 5 128 - 129a/130 - 139a in PBS-Dulbecco
pH 7,4 (ohne Ca2*/Mg2*) 128
Tabelle 45 : L-4,5[3H]-Leucin/[35S]-Sulfat Verhältnis im Verlauf der
Isolationsschritte 129
Tabelle 46: TSK 1 (128 - 139a) Einsatz nach Abbau durch Heparinase l/Ml in
HSC-Kulturen 133
Tabelle 47: Einsatz von TSK 1 129 - 139a nach Abbau durch Heparitinase I in
HSC Kulturen 134
Tabelle 48: Einfluß von SD 1 auf andere Zellkulturpopulationen 144
Tabelle 49: Reversibilität des TSK Effekts auf HSC-Kulturen im
Running on Assay 147
Tabelle 50: Reversibilität des TSK Effekts auf HSC-Kulturen im
Turning on Assay 147
Tabelle 51 : Gesamtbiosynthese unter Einfluß von TSK 1 nach der Methode von
Mansund Novelli 149
Tabelle 52: Veränderung des [3H]-Thymidineinbaus in HSC unter TSK 1 in
Gegenwart unterschiedlicher FKS Anteile 150
Tabelle 53: Wirkung von TSK 1 auf HSC in Gegenwart von über Heparin-
Sepharose chromatographiertes FKS 153
Tabelle 54: [3H]-Thymidineinbau der HSC in Gegenwart von TSK 1 unter
Berücksichtigung des Kompartiments Zytosol 155
Tabelle 55: Vergleich der prozentualen Aminosäureverteilung von Zn-a2-
Glycoprotein mit der des Faktors 168
Tabelle 56: Vergleich der prozentualen Aminosäureverteilung von Syndecan-1
mit dem isolierten Faktor 176
Tabelle 57: Vergleich der prozentualen Aminosäureverteilung von Syndecan-2
mit dem isolierten Faktor 177
Tabelle 58: Vergleich der prozentualen Aminosäureverteilung von Syndecan-4
mit dem isolierten Faktor 178
Tabelle 59 Vergleich der prozentualen Aminosäureverteilung von Betaglycan
mit dem isolierten Faktor 179
273
Tabellenverzeichnis
Tabelle 60: Vergleich der prozentualen Aminosäureverteilung von Kollagen VIII
alpha mit dem isolierten Faktor 181
Tabelle 61. Vergleich der prozentualen Aminosäureverteilung von Perlecan mit
dem isolierten Faktor 183
Tabelle 62: Vergleich der prozentualen Aminosäureverteilung von Syndecan-3
mit dem isolierten Faktor 184
Tabelle 63: Vergleich der prozentualen Aminosäureverteilung von Agrin mit
dem isolierten Faktor 186
Tabelle 64: Vergleich der prozentualen Aminosäureverteilung von Glypican-1
mit dem isolierten Faktor 188
Tabelle 65: Vergleich der prozentualen Aminosäureverteilung von Glypican-2
mit dem isolierten Faktor 189
Tabelle 66: Vergleich der prozentualen Aminosäureverteilung von Glypican-3
mit dem isolierten Faktor 190
Tabelle 67: Vergleich der prozentualen Aminosäureverteilung von Glypican-4
mit dem isolierten Faktor 191
Tabelle 68: Vergleich der prozentualen Aminosäureverteilung von Glypican-5
mit dem isolierten Faktor 192
Tabelle 69. Vergleich der prozentualen Aminosäureverteilung von Glypican-6
mit dem isolierten Faktor 193
Tabelle 70: Vergleich der prozentualen Aminosäureverteilung von Decorin mit
dem isolierten Faktor 195
Tabelle 71: Vergleich der prozentualen Aminosäureverteilung von Biglycan mit
dem isolierten Faktor 196
Tabelle 72: Vergleich der prozentualen Aminosäureverteilung von Lumican mit
dem isolierten Faktor 197
Tabelle 73: Vergleich der Aminosäureanalytik des Faktors mit den in der Leber
exprimierten Heparansulfatproteoglykanen und Proteoglykanen mit
bekannt inhibitorischer Wirkung unter Berücksichtigung der
Analysetechnik und der Annahme, dass Prolin und Cystein dem
Nachweis durch die hier verwendete Analysemethode entgehen 198
274
III Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Leberhistologie 5
Abbildung 2: HSC und Hepatozyt (schematische Darstellung) 24
Abbildung 3. Molekulargewichtsbestimmung in Abhängigkeit zum Elutions-
koeffizienten bei der Superdex 200 Chromatographie 68
Abbildung 4: Molekulargewichtsbestimmung in Abhängigkeit zum
Elutionskoeffizienten der Sepharase-CL 6B Chromatographie 69
Abbildung 5: Molekulargewichtsbestimmung in Abhängigkeit zum
Elutionskoeffizienten der TSK G2000 SW Chromatographie 71
Abbildung 6: Molekulargewichtsbestimmung in Abhängigkeit zum
Elutionskoeffizienten der TSK G3000 SW Chromatographie 72
Abbildung 7. [3H]-Thymidineinbauraten und Schädigungsparameter des
Kontroll-PCcM 83
Abbildung 8: [3H]-Thymidineinbaurate/Schädigungsparameter N2 Atmosphäre
gewonnenen PCcM 84
Abbildung 9. SDS Gelelektrophorese 85
Abbildung 10: [3H]-Thymidineinbauraten und Schädigungsparameter des
Kontroll-PCcM 87
Abbildung 11: [3H]-Thymidineinbauraten und Schädigungsanzeigende Parameter
desCCCP-PCcM 88
Abbildung 12: [3H]-Thymidineinbaurate/Schädigungsanzeigende Parameter unter
TBHP-PCcM 90
Abbildung 13: [3H]-Thymidineinbaurate/Schädigungsanzeigende Parameter unter
A23187-PCCM 91
Abbildung 14: Vergleich von unbehandelten (links) und mit Dexamethason (rechts)
inkubierten Hepatozytenkulturen in 10 (oben) und 20facher (unten)
mikroskopischer Vergrößerung 93
Abbildung 15 Modifikation der PCcM Wirkung auf HSC durch Dexamethason 94
Abbildung 16: Modifikation der PCcM Wirkung auf HSC durch PGE2 96
Abbildung 17: Modifikation der PCcM Wirkung auf HSC durch PMA 97
Abbildung 18: Agarosegel nach Restriktionsenzymverdau von 0,235 kb Fragment
TGF-alpha pBS(+) Plasmid 3204 bp und 0,5 kb Fragment Albumin
pGEM 1 Plasmid 2865 bp 99
Abbildung 19 AML TGF-alpha Antisense 100
Abbildung 20: AML TGF-alpha Sense 100
Abbildung 21: Hepatozyten Albumin Antisense 101
Abbildung 22 Hepatozyten Albumin Sense 101
Abbildung 23: Hepatozyten TGF-alpha Antisense 102
275
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 24: Hepatozyten TGF-alpha Sense 102
Abbildung 25: S-Sepharose ff Chromatographie von PCcM 80/80a/81 104
Abbildung 26: [3H]-Thymidineinbau, Arginaseaktivität und Proteinmenge in
Gegenwart von PCcM und S 1 -4 der Charge 80/80a/81 106
Abbildung 27. Superdex 200 p.g. High load 16/60 Chromatographie von S 1
Charge 80/80a/81 108
Abbildung 28: [3H]-Thymidineinbau, Arginaseaktivität und Proteinmenge in Gegenwart
von PCcM/S 1 und SD 1 -4 der Charge 80/80a/81 110
Abbildung 29: DEAE-Sephacel Anionenaustauscherchromatographie 1,0/5
(3,92 ml) Chromatographie von SD 1 Charge 52a/73/86-90a 112
Abbildung 30: [3H]-Thymidineinbau, Arginaseaktivität, Uronsäure- und Proteinmenge
von DEAE 1 - 4 der Charge 52a/73/86 - 90a 114
Abbildung 31. DEAE-Sephacel Anionenaustausch-Chromatographie 1,0/5
(3,92 ml) von SD 1 94 - 95a 116
Abbildung 32 :[3H]-Thymidineinbau, Arginaseaktivität und Proteinmenge von
PCcM, S 1, SD1 und DEAE 1 -6 94-95a 118
Abbildung 33: [3H]-Thymidineinbau in HSC-Kulturen nach Dialyse des Faktors
unter dissoziativen Puffern 120
Abbildung 34: TSK G2000 SW Chromatographie von
DEAE 5 116- 118a/120- 126a 121
Abbildung 35: [3H]-Thymidineinbaurate der HSC-Kulturen in Gegenwart von
TSK 1 -4 116-118a/120-126a 122
Abbildung 36 :TSK G2000 SW Chromatographie von DEAE 116 - 118a/120 - 126a
Kontrolle und Trypsin Abbau 123
Abbildung 37 : Einsatz des trypsinbehandelten DEAE 5 116 - 126a in 10 % FKS
kultivierten HSC 125
Abbildung 38: TSK G2000 SW Chromatographie von DEAE 5 128 - 129a/
130 - 139a in 10 mM Tris-HCL, 100 mMol NaCI pH 7.0 127
Abbildung 39: Prozentuale Verteilung der Aktivität von L-4,5[3H]-Leucin/[35S]-Sulfat
im Verlauf der Isolationsschntte 129
Abbildung 40: Sepharose-CL 6B Chromatographie der nativen und der
ß-Eliminierten DEAE 5 119/119a 130
Abbildung 41: Abbau der radioaktiv markierten DEAE 5 (119/119a) mit an¬
schließender TSK G2000 SW Chromatographie 131
Abbildung 42: Enzymatische Spaltung der typischen Pentasacchandeinheit durch
Heparinase I und III 132
Abbildung 43: Einsatz von TSK 1 128 - 139a nach Heparinase l/HI Abbau in HSC-
Kulturen 133
276
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 44: Einsatz des TSK 1 in HSC Kulturen nach Abbau durch
Heparitinase I 134
Abbildung 45: TSK 3000 SW Chromatographie von TSK 1 135
Abbildung 46: TSK 3000 SW Chromatographie des TSK 1 Abbaus durch
Heparitinase I 136
Abbildung 47: TSK 3000 SW Chromatographie von Heparitinase I und BSA Puffer. 137
Abbildung 48 TSK 1 Abbau durch Heparitinase I in der SDS-Elektrophorese 138
Abbildung 49: Heparin-Sepharose Chromatographie des mittels Heparitinase I
abgebauten TSK 1 Pools 139
Abbildung 50: TSK G2000 SW Chromatographie von Peak-Fraktion 10 140
Abbildung 51: TSK G2000 SW Chromatographie von Peak-Fraktion 14 141
Abbildung 52: TSK G2000 SW Chromatographie von Peak-Fraktion 56 142
Abbildung 53: Wirkung von SD 1 auf unterschiedliche Zellpopulationen 145
Abbildung 54: Reversibilität des TSK-Effekts auf HSC-Kulturen (Running on Assay)148
Abbildung 55: Reversibilität des TSK-Effekts auf HSC-Kulturen (Turning on Assay) 148
Abbildung 56: Gesamtbiosynthese unter Einfluß von TSK 1 nach der Methode von
Mans und Novelli 149
Abbildung 57: Veränderung des [3H]-Thymidineinbaus in HSC unter TSK 1 in
Gegenwart unterschiedlicher FKS-Anteile 151
Abbildung 58: Heparin-Sepharose Chromatographie von FKS 152
Abbildung 59: Wirkung von TSK 1 auf HSC in Gegenwart von Heparin-
Sepharose chromatographiertem FKS 154
Abbildung 60: [3H]-Thymidineinbau der HSC in Gegenwart von TSK 1 unter
Berücksichtigung des: Zytosol 156
Abbildung 61: TSK G2000 SW Chromatographie von TSK 1 nach Inkubation mit
[3H]-Thymidin 157
Abbildung 62: Proteinsequenz des Zn-u2-Glycoprotein-Präkursors 168
Abbildung 63: Proteinsequenz von Syndecan-1-Präkursors 176
Abbildung 64: Proteinsequenz des Syndecan-2-Präkursors 177
Abbildung 65: Proteinsequenz von Syndecan-4-Präkursors 178
Abbildung 66: Proteinsequenz des Betaglycan-Präkursors 179
Abbildung 67: Proteinsequenz des Kollagen VIII alpha Präkursors 180
Abbildung 68- Proteinsequenz des Perlecan-Präkursor 182
Abbildung 69: Proteinsequenz des Syndecan-3-Präkursors 184
Abbildung 70: Proteinsequenz des Agrin-Präkursors 185
Abbildung 71: Proteinsequenz des Glypican-1-Präkursors 188
Abbildung 72: Proteinsequenz des Glypican-2-Präkursors 189
Abbildung 73: Proteinsequenz von Glypican-3-Präkursors 190
277
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 74: Proteinsequenz des Glypican-4-Präkursors 191
Abbildung 75: Proteinsequenz des Glypican-5-Präkursors 192
Abbildung 76: Proteinsequenz des Glypican-6-Präkursors 193
Abbildung 77: Proteinsequenz des Decorin-Präkursors 194
Abbildung 78: Proteinsequenz des Biglycan- Präkursors 195
Abbildung 79: Proteinsequenz des Lumican-Präkursors 196
278
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