Nachweis einer ausgeprägten proinflammatorischen Reagibilität der Koronarendothelzellen am Modell der "patientenspezifischen" Endothelzellkultur:
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2005
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| Beschreibung: | Regensburg, Univ., Diss., 2005 |
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Endothelzellforschung 1
1.2 Untersuchte Zytokine 2
1.2.1 Interieukin6 2
1.2.2 Interieukin8 4
1.3 Ziel dieser Arbeit 4
2 Methoden 6
2.1 Zellkultur 6
2.1.1 Regeln für steriles Arbeiten in der Zellkultur 6
2.1.2 Isolierung humaner Endothelzellen aus Blutgefäßen 7
2.1.2.1 HSVEC 7
2.1.2.2 HUVEC 8
2.1.2.3 HCAEC 8
2.1.3 Kultivierung und Passagieren humaner Endothelzellen 9
2.1.3.1 Allgemein 9
2.1.3.2 Codierung der Zellkultur 10
2.1.3.3 Zellzählung 11
2.1.4 Einfrieren und Auftauen von Endothelzellen 12
2.1.5 Fixieren von Endothelzellen 13
2.2 Immunhistochemische Charakterisierung der Endothelzellen 13
2.3 Zytotoxizitätsnachweis: Bestimmung der freigesetzten
Lactatdehydrogenase (LDH) 15
2.4 Bestimmung der Konzentration von IL-6 und IL-8 mittels ELISA 17
2.4.1 lnterieukin-6-ELISA 17
2.4.2 lnterieukin-8-ELISA 18
2.5 3H-Thymidin-Einbau als Proliferationskontrolle 20
2.6 Überprüfung der Reinheit der Ausgangskulturen mittels
Durchflusszytometrie 21
2.6.1 Prinzip der Durchflusszytometrie 21
2.6.2 Vorbereitung der Zellen 22
2.6.3 Messung 22
2.7 Gas- und Elektrolytmessung 24
2.8 Studiendesign 24
2.9 Patientengut 24
2.10 Zeitlicher Ablauf eines Versuchs 25
2.11 Versuchsprotokoll und Zeitplan 26
3 Ergebnisse 29
3.1 Etablierung eines Zytotoxizitätsnachweises bei Langzeitkultur
von humanen Endothelzellen (LDH-Aktivitätsmessung) 29
3.1.1 Einfluss von Medienbestandteilen auf die LOH-Aktivität 29
3.1.2 LDH-Konzentration im Zytosol von Endothelzellen (Totallyse) 30
3.1.2.1 Titration der zur vollständigen Lyse der Endothelzellen nötigen
Konzentration von TritonX-100 31
3.1.2.2 Bestimmung der Konzentration der LDH im Zytosol pro Zelle 32
3.2 Spontane Freisetzung von LDH als Maß für die Vitalität der Zellen 33
3.3 Untersuchung des Wachstumsverhaltens von Endothelzellen aus
verschiedenen Geweben 36
3.3.1 Kontrolle der Kulturbedingungen 36
3.3.1.1 Volumen 36
3.3.1.2 pH-Verlauf 37
3.3.1.3 Elektrolythaushalt 38
3.3.2 Wachstumsverhalten der Endothelzellen verschiedener
Herkunft (Wachstumsverlauf über 6 Tage) 40
3.3.2.1 Morphologie und Reinheit der Kulturen 40
3.3.2.2 Wachstumskurve 43
3.3.2.2.1 Zellwachstum 43
3.3.2.2.2 Veränderung der Zellgröße über einen Inkubationszeitraum
von 144h 45
3.3.2.2.3 Vitalität 48
3.3.2.2.4 Proliferation 51
3.3.2.3 Freisetzung von lnterleukin-6 und -8 während des Wachstums 53
3.3.2.3.1 lnterieukin-8 53
3.3.2.3.2 lnterleukin-6 55
3.4 Sonderfälle 59
3.4.1 Untersuchung einer Mischkultur 59
3.4.2 Auswirkungen von Serum einer inkompatiblen Blutgruppe
auf die Stoffwechseleigenschaften von Zellen 60
3.4.3 Untersuchungen an EC aus einem gesunden humanen
rechten Vorhof 61
4 Diskussion 62
4.1 Modell der EC-Kultur 62
4.2 Wachstumskurven, Zellgröße, Proliferation und Zellschädigung 63
4.3 Heterogenität 64
4.4 Die Rolle von lnterleukin-6 bei Herzerkrankungen 65
4.5 lnterleukin-6 und lnterleukin-8 69
5 Literaturverzeichnis 71
6. Anhang 77
6.1 verwendete Lösungen und Medien 77
6.2 Mengen, Größen, Flächen, Volumina (Tabelle 8) 79
6.3 Abkürzungsverzeichnis 79
6.4 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 81
6.5 Materialliste 83
6.6 Lebenslauf 86
6.7 Danksagung 88
6.4 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis
Abbildung 1: konfluenter HSVEC-Monolayer S. 10
Abbildung 2: sich aus dem Monolayer auslösende Zellen S. 10
Abbildung 3: Eichkurve für die LDH-Bestimmung S. 16
Abbildung 4: Mittelwerte mit Standardabweichungen aus 4 Standardkurven
des IL-6-ELISAs S. 18
Abbildung 5: Mittelwerte mit Standardabweichungen aus 5 Standardkurven
von IL-8-ELISAs S. 19
Abbildung 6a: Durchflußzytometrische Darstellung einer nahezu reinen
Endothelzellkultur S. 23
Abbildung 6b: Durchflußzytometrische Darstellung einer Mischkultur S. 23
Abbildung 7: Beispiel zum Einfluss der Konzentration von FKS und
Humanserum auf die Aktivität der LDH S. 30
Abbildung 8: Schwellenkonzentration von TritonX-100 für die Totallyse von
HSVEC S. 31
Abbildung 9: Bestimmung der Konzentration der zytosolischen LDH in
Abhängigkeit von der Zellzahl S. 33
Abbildung 10: Spontane Freisetzung von LDH als Maß für die Vitalität der
Zellen S. 35
Abbildung 11: Volumenänderung über 144 Stunden S. 37
Abbildung 12: pH-Verlauf über 144 Stunden S. 38
Abbildung 13: Konzentrationsänderung von Kalium und Natrium über 144
Stunden S. 39
Abbildung 14: Konfluenz der Kulturen über einen Versuchszeitraum von 144
Stunden S. 40
Abbildung 15a: Anti-CD31 -Färbung, FITC-gekoppelt, bei konfluentem Zellrasen
S. 42
Abbildung 15b: Anti-vWF-Färbung S. 42
Abbildung 16: Vergleich von zwei Zählmethoden S. 43
Abbildung 17a: Wachstumsverläufe der Zellkulturen unterschiedlicher Herkunft
im Einzelverlauf nach CASY-Zählung S. 44
Abbildung 17b: Mittelwert-Wachstumskurven aller Kulturen nach CASY-Zählung
und Neubauer-Zählung S. 45
-81-
Abbildung 18: Messung des Zelldurchmessers und -volumens mittels CASY
S. 46
Abbildung 19: Durchschnittliche Durchmesser der Zellen und Zellvolumina
S.47
Abbildung 20: Lineare Abnahme der LDH-Aktivität im Medium über 12 Tage
S. 49
Abbildung 21: Absorptionszuwachs bei der LDH-Messung im Überstand von
Endothelzellen unterschiedlicher Herkunft S. 50
Abbildung 22: Proliferationskurven von EC aus verschiedenen Geweben im 3H-
Versuch S. 52
Abbildung 23: IL-8-Konzentrationen im Überstand von Endothelzellen
verschiedener Herkunft im Verlauf von 144 Stunden S. 54
Abbildung 24: IL-8 Gehalt im Überstand von Endothelzellen verschiedener
Herkunft im Verlauf von 144 Stunden S. 55
Abbildung 25: IL-6-Konzentrationen im Überstand von Endothelzellen
verschiedener Herkunft im Verlauf von 144 Stunden S. 57
Abbildung 26: IL-6 Gehalt im Überstand von Endothelzellen verschiedener
Herkunft im Verlauf von 144 Stunden S. 58
Abbildung 27: Wachstums- und Interieukinkurven einer Mischkultur aus A.
coronaria dextra S. 59
Abbildung 28: Auswirkungen von Serum einer inkompatiblen Blutgruppe auf die
Stoffwechseleigenschaften von Zellen S. 60
Abbildung 29: Untersuchungen an EC aus einem gesunden humanen rechten
Vorhof S. 61
Tabelle 1: Übersicht zur Bestückung der Objektträger zur immunhistochemischen
Reinheitsüberprüfung S. 14
Tabelle 2: Mittlere Reinheitsgrade der in die Versuche eingegangenen
Ausgangskulturen S. 41
Tabelle 3: Messung des Zelldurchmessers und -volumens mittels CASY S. 46
Tabelle 4: Durchschnittliche Durchmesser der Zellen und Zellvolumina S. 47
Tabelle 5: Proliferationskurven von EC aus verschiedenen Geweben im 3H-
Versuch S. 52
-82-
Tabelle 6: IL-6-Konzentrationen im Überstand von Endothelzellen verschiedener
Herkunft im Verlauf von 144 Stunden S. 57
Tabelle 7: Übersicht über Studien die sich mit dem Zusammenhang der IL-6-
Freisetzung und der akuten Abstossungsreaktion befassen S. 68
Tabelle 8: Mengen-Größen-Flächen-Volumina S. 79
-83-
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