Assemblierung metallbindender Proteine im Intermembranraum und in der Matrix von Mitochondrien:
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INHALTSVERZEICHNIS
VERWENDETE
ABKUERZUNGEN
VII
1
EINLEITUNG
1
1.1
PROTEINIMPORT
IN
MITOCHONDRIEN
.
2
1.1.1
DER
TOM-KOMPLEX
.
2
1.1.2
PROTEINTRANSLOKATION
UEBER
AUSSEN
UND
INNENMEMBRAN
.
4
1.1.3
PROTEINIMPORT
IN
DEN
INTERMEMBRANRAUM
.
5
1.2
BIOSYNTHESE
VON
FE/S-CLUSTERN
.
6
1.2.1
FE/S-PROTEINE
.
6
1.2.2
KOMPONENTEN
DER
ISC-MASCHINERIE
.
6
1.2.3
BIOSYNTHESE
CYTOSOLISCHER
FE/S-CLUSTER
.
9
1.3
FRAGESTELLUNG
UND
ZIELSETZUNG
.
9
2
MATERIAL
UND
METHODEN
11
2.1
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
11
2.1.1
ISOLIERUNG
VON
PLASMIDEN
AUS
E.
COLI
.
11
2.1.2
POLYMERASE-KETTENREAKTION
.
11
2.1.3
KLONIERUNG
VON
DNS-FRAGMENTEN
.
12
2.1.3.1
RESTRIKTIONSVERDAU
.
12
2.1.3.2
LIGATION
.
12
2.1.3.3
ZWISCHENKLONIERUNG
.
12
2.1.3.4
PRAEPARATION
KOMPETENTER
E.
CO/Z-ZELLEN
.
13
2.1.3.5
TRANSFORMATION
VON
E.
CO/Z-ZELLEN
.
13
2.1.4
REINIGUNG
UND
ANALYSE
VON
DNS
.
13
2.1.4.1
ANALYTISCHE
UND
PRAEPARATIVE
GELELEKTROPHORESE
.
13
2.1.4.2
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
.
13
2.1.5
VERWENDETE
PLASMIDE
.
14
2.1.6
KLONIERUNGSSTRATEGIEN
.
15
2.2
GENETISCHE
METHODEN
.
17
2.2.1
VERWENDETE
STAEMME
VON
E.
COLI
.
17
2.2.2
VERWENDETE
STAEMME
VON
S.
CEREVISIAE
.
18
2.2.3
ANZUCHT
VON
S.
CEREVISIAE
.
18
2.3
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
.
18
IV
INHALTSVERZEICHNIS
2.3.1
ELEKTROPHORETISCHE
METHODEN
.
18
2.3.1.1
SDS-GELELEKTROPHORESE
.
18
2.3.1.2
HARNSTOFF-GELELEKTROPHORESE
.
19
2.3.1.3
NATIVE
GELELEKTROPHORESE
VON
YAHL
.
19
2.3.1.4
FAERBEN
UND
TROCKNEN
VON
POLYACRYLAMID-GELEN
.
19
2.3.1.5
TRANSFER
VON
PROTEINEN
AUF
NITROZELLULOSE-MEM
BRANEN
.
19
2.3.2
AUTORADIOGRAPHIE
UND
DENSITOMETRIE
.
20
2.3.3
SYNTHESE
VON
35
S-MARKIERTEN
PROTEINEN
IN
VITRO
.
20
2.3.4
BESTIMMUNG
VON
PROTEINKONZENTRATIONEN
.
20
2.3.5
FAELLUNG
VON
PROTEINEN
DURCH
TCA
.
21
2.3.6
UBEREXPRESSION
UND
REINIGUNG
VON
PROTEINEN
.
21
2.3.6.1
REINIGUNG
VON
SSQL
UND
JACL
.
21
2.3.6.2
REINIGUNG
VON
TIML3
.
22
2.3.6.3
REINIGUNG
VON
YAHL
UND
NFSL
.
22
2.3.7
DERIVATISIERUNG
VON
PROTEINEN
.
22
2.3.7.1
DERIVATISIERUNG
MIT
AMS
.
22
2.3.7.2
DERIVATISIERUNG
MIT
NEM
.
23
2.3.8
PROTEINFALTUNGSEXPERIMENTE
MIT
TIML3
.
23
2.4
ZELLBIOLOGISCHE
METHODEN
.
23
2.4.1
ISOLIERUNG
VON
MITOCHONDRIEN
AUS
HEFE
.
23
2.4.2
IMPORT
VON
PROTEINEN
IN
MITOCHONDRIEN
.
24
2.4.3
BESTIMMUNG
VON
ENZYMAKTIVITAETEN
.
25
2.4.3.1
BESTIMMUNG
DER
LDH-AKTIVITAET
.
25
2.4.3.2
BESTIMMUNG
DER
MDH-AKTIVITAET
.
25
2.4.3.3
BESTIMMUNG
DER
SDH-AKTIVITAET
.
26
2.4.3.4
BESTIMMUNG
DER
ACONITASE-AKTIVITAET
.
26
2.5
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
.
26
2.5.1
HERSTELLUNG
SPEZIFISCHER
ANTISEREN
IN
KANINCHEN
.
26
2.5.2
VERWENDETE
ANTIKOERPER
.
'.
.
26
2.5.3
REINIGUNG
VON
ANTIKOERPERN
.
27
2.5.4
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
AUF
NITROZELLU
LOSE-MEMBRANEN
(WESTERNBLOT)
.
28
2.5.5
IMMUNPRAEZIPITATIONS-EXPERIMENTE
.
28
2.6
PUFFER
UND
MEDIEN
.
29
2.7
CHEMIKALIEN
UND
VERBRAUCHSMATERIAL
.
29
2.8
GERAETE
.
30
3
ERGEBNISSE
33
3.1
IMPORT
VON
TIML3
.
33
3.1.1
TIML3
WIRD
UEBER
DEN
TOM-KOMPLEX
IMPORTIERT
.
33
3.1.2
IMPORT
VON
TIML3
IST
UNABHAENGIG
VON
ATP
.
34
3.1.3
DAS
CYSTEINMOTIV
VON
TIML3
IST
FUER
DEN
IMPORT
ESSENTIELL
36
INHALTSVERZEICHNIS
V
3.1.4
ENDOGENES
TIML3
LIEGT
IN
REDUZIERTER
FORM
VOR
.
38
3.1.5
REKOMBINANTES
TIML3
BINDET
ZN
2+
.
39
3.1.6
FALTUNG
VON
TIML3
.
39
3.1.6.1
ENDOGENES
TIML3
BESITZT
EINE
GEFALTETE
DOMAENE
.
39
3.1.6.2
TIML3
FALTET
SICH
WAEHREND
DES
IN
VITRO-IMPORTS
.
41
3.1.6.3
DIE
FALTUNG
VON
TIML3
IST
ZN
2+
-STABILISIERT
.
41
3.1.7
TRANSLOKATION
UND
FALTUNG
VON
TIML3
.
42
3.1.7.1
REKOMBINANTES
TIML3
IST
IMPORTKOMPETENT
.
42
3.1.7.2
TIML3
IST
NUR
IN
UNGEFALTETEM
ZUSTAND
IMPORT
KOMPETENT
.
43
3.1.7.3
ZN
2+
IST
FUER
DEN
IMPORT
VON
TIML3
NOTWENDIG
.
.
43
3.1.7.4
DIE
FALTUNG
VON
TIML3
IST
FUER
DIE
TRANSLOKATION
NOTWENDIG
.
45
3.2
SSQL
UND
JACL
IN
DER
FE/S-CLUSTER-BIOSYNTHESE
.
46
3.2.1
SSQL
INTERAGIERT
MIT
MGEL
.
46
3.2.2
SSQL
INTERAGIERT
NICHT
MIT
TIM44
.
48
3.2.3
SSQL
UND
JACL-MUTANTEN
ZEIGEN
REDUZIERTE
SDH-AKTIVITAET
48
3.2.4
APO
UND
HOLO-YAHL
KOENNEN
DURCH
NATIVGELELEKTROPHORESE
GETRENNT
WERDEN
.
49
3.2.5
KINETIK
DER
FE/S-CLUSTER-BIOSYNTHESE
.
53
3.2.6
SSQL
UND
JACL
SIND
FUER
DIE
ASSEMBLIERUNG
VON
FE/S-CLUSTERN
NOTWENDIG
.
55
3.2.7
YFHL
IST
FUER
DIE
ASSEMBLIERUNG
VON
FE/S-CLUSTER
NOTWENDIG
57
4
DISKUSSION
59
4.1
IMPORT
VON
TIML3
IN
DEN
INTERMEMBRANRAUM
.
59
4.1.1
TRANSLOKATION
UEBER
DEN
TOM-KOMPLEX
.
59
4.1.2
IMPORT
IN
DEN
INTERMEMBRANRAUM
.
60
4.1.3
OXIDATIONSZUSTAND,
ZINKBINDUNG
UND
FALTUNG
VON
TIML3
.
62
4.1.4
KOFAKTORASSEMBLIERUNG
UND
PROTEINIMPORT
.
63
4.2
FE/S-CLUSTER
ASSEMBLIERUNG
IN
MITOCHONDRIEN
.
65
4.2.1
SSQL,
JACL
UND
MGEL
ALS
HSP70-CHAPERONSYSTEM
.
65
4.2.2
IN
VITRO-ASSEMBLIERUNG
DES
FE/S-CLUSTERS
VON
YAHL
.
65
4.2.3
SSQL
UND
JACL
IN
DER
FE/S-CLUSTER-BIOGENESE
.
66
4.2.4
YFHL
IN
DER
FE/S-CLUSTER-BIOGENESE
.
68
5
ZUSAMMENFASSUNG
69
6
LITERATUR
70
VEROEFFENTLICHUNGEN
83
DANKSAGUNG
85
VI
INHALTSVERZEICHNIS
LEBENSLAUF
87 |
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