Praktische Biochemie: Grundlagen und Techniken ; 19 Tabellen
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Stuttgart [u.a.]
Thieme
2003
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VII
Einleitung
Standardmethoden der Biowissenschaften
3.2.4
3.2.5
3.2.6
3.2.7
1
Versuchsorganismen
3.3
und ihre Anzucht ··· 5
3.3.1
1.1
Mikroorganismen ··· 5
1.1.1
Mikroalgen
···
S
4
1.2
Zellkulturen ··· 9
1.2.1
Pflanzliche Zellkulturen ··· 9
4.1
1.2.2
Tierische Zellkulturen ·■·
II
4.1.1
1.2.3
Zellzahl und Zellmasse ··· 16
4.2
1.2.4
Kryokonservierung ··■ 18
4.2.1
1.2.5
Typen- und Stammsammlungen · · · 19
1.3
Pilze ··· 19
4.2.2
1.4
Pflanzen ■·· 20
1.5
Tiere ··· 22
4.2.3
1.5.1
Tierversuche ··· 23
4.2.4
4.2.5
2
Zellaufschluss und
4.2.6
Zellfraktionierung -■- 25
4.2.7
2.1
Aufschlussmedien ··· 25
4.3
2.2
Techniken ■·· 25
4.3.1
2.3
Fraktionierung ··· 27
4.3.2
2.3.1
Zentrifugation ··· 27
4.3.3
2.3.2
Verfahren ··· 31
4.4
2.4
Charakterisierung isolierter Zellkom¬
4.4.1
ponenten ··· 36
4.4.2
2.4.1
Leitverbindung und Leitenzym · · ■ 36
4.5
2.4.2
Stoffwechselaktivitäten ··· 37
4.5.1
2.4.3
Antikörper ·■· 39
2.4.4
Radioaktive Markierung · · · 40
4.5.2
4.5.3
3
Chromatographie ··· 41
4.6
3.1
Theoretische Grundlagen
4.7
der Chromatographie · · · 42
4.7.1
3.2
Flüssigkeitschromatographie ··· 44
4.7.2
3.2.1
Adsorptionschromatographie ··· 47
4.7.3
3.2.2
Verteilungschromatographie · · · 49
4.7.4
3.2.3
Ionenaustausch-ChromatoffraDhie · · · 52
Affinitätschromatographie · · · 54
Ausschlusschromatographie ··· 58
Dünnschichtchromatographie ··· 60
Hochleistungsflüssigkeits-
chromatographie (HPLC) ··· 62
Gaschromatographie ··· 66
Säulen ··· 67
Elektrophorese
71
71
81
84
85
Theoretische Grundlagen
Elektroendosmose ··· 72
Gelelektrophorese ■·· 73
Herstellung der Gele und ihre
Eigenschaften ··· 74
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(PAGE) ··· 76
Diskontinuierliche Polyacrylamid-
Gelelektrophorese (Disk-PAGE)
Agarose-Gelelektrophorese · · ■
Präparative Gelelektrophorese
Pulsfeld-Gelelektrophorese · · ·
Zweidimensionale
Gelelektrophorese ·■· 85
Auswertung von Trenngelen · ■
Anfärbung ··· 86
Autoradiographie
··· 87
Quantitative Auswertung
Blotting-Technik ··· SS
Southern-Blotting
··· 88
Western-Blotting
··· 89
Isoelektrische Fokussierung (IEF) ···
Herstellung von Gelen mit
pH-Gradienten ·■■ 90
Trennvorgang ··· 91
Zweidimensionale Gelelektrophorese
(2D-GE) .·. 92
Elektrophorese in
Celluloseacetat-Folien ··· 94
Kapillarelektrophorese (KE) ·
Theorie ··· 95
Standardapparatur ··· 95
Verfahren · ■ · 96
Kapillar-Zonenelektrophorese
(KZE) ··· 96
78
83
88
90
94
VIII
Inhaltsverzeichnis
4.7.5 Kapillar-Gelelektrophorese (KGE) ··· 97
4.7.6 Micellarelektrokinetische
Kapillarchromatographie
(MEKC)
■·· 97
АЛЛ
Auswertung ··· 98
Spektroskopie ··· 99
Spektroskopie mit ultravioletter und
sichtbarer Strahlung · · · 707
Absorptionsmessung ··· 101
Fluoreszenzspektroskopie
(Spektrofluorimetrie) ··· 108
Quantitative Analyse ··· 108
Messvorrichtungen · · · 109
Anwendung ■··
J
70
Infrarot-Spektroskopie ··· 112
Grundlagen ··· 112
Geräte ···
7Î2
Anwendung ··· 77-4
Raman-Spektroskopie ··· 114
Technik ■■· 114
Geräte ···
IÍ5
ElektronenspinresonanzCESRi-Spektro
skopie
··· 115
Grundlagen ··· 116
Geräte ···
J
16
Anwendung ··· 117
Kernspinresonanz-Spektroskopie ··· 777
Grundlagen ··■ 777
Messprinzipien ··· 777
Eindimensionale Verfahren ··· 178
Zweidimentionale Verfahren · · · 720
Geräte ··· 727
Anwendung ··· 727
Spektroskopie mit
polarisiertem Licht ··· 722
Optische Rotation ··· 722
Optische Rotationsdispersion
(ORD)
··· 722
Circulardichroismus (CD) ··· 722
Geräte ··· 722
Anwendungen ··· 723
Massenspektrometrie
729
5.1
5.1.1
5.2
5.2.1
5.2.2
5.2.3
5.3
5.3.1
5.3.2
5.3.3
5.4
5.4.1
5.4.2
5.5
5.5.1
5.5.2
5.5.3
5.6
5.6.1
5.6.2
5.6.3
5.6.4
5.6.5
5.6.6
5.7
5.7.1
5.7.2
5.7.3
5.7.4
5.7.5
6.1
6.2
6.2.1
6.2.2
6.2.3
6.2.4
6.3
Röntgenstrukturanalyse ·■· 725
Kristallisation ··· 725
Röntgenbeugung ··· 726
Theoretische Grundlagen ··· 726
Technik ··· 726
Elektronendichte ··· 127
Auswertung und Darstellung · · · 727
Geräte ··· 728
7.1 Ionisierungs- und Messverfahren · · · 729
7.1.1 Elektronenstoß-Ionisierung (ESI) ··· 729
7.1.2 Isotopenverhältnis-Massenspektroskopie
(IRMS) ··· 729
7.1.3 Chemische Ionisierung
(CI)
··· 730
7.1.4 lonen-Desorption ··· 730
7.1.5 Ionisierung durch schnellen
Atombeschuss ··· 730
7.1.6 Sprüh-Ionisierung ··· 733
7.2 Geräte ··· 734
7.2.1 Analysatoren ··· 134
7.2.2 Detektoren ··· 736
7.3 Massenspektrometrische Peptid-
und Proteinsequenzierung ··· 737
Spezielle Verfahren der Molekularbiologie
8 Nukleinsäuren ··· 747
8.1 Deoxyribonukleinsäure (DNA) ··· 747
8.1.1 Isolierung von DNA · · ·
Í4J
8.1.2 Präzipita
tion
und
Mengenbestimmung ··· 742
8.1.3 Reinigung von DNA ··· 742
8.1.4 Isolierung von Plasmid-DNA ··· 743
8.1.5 Isolierung von Phagen-DNA · · · 744
8.1.6 Isolierung von Chromosomen-
DNA ··■ 744
8.2 Deoxyribonukleinsäure-Analyse ··· 744
8.2.1 Physikalische Eigenschaften · · · 744
8.2.2 Enzymatische Modifizierung
von DNA ··· 746
8.3 DNA-Synthese ··· 747
8.3.1 Organisch-chemisches Verfahren ·■· 747
8.3.2 Biosynthese ··· 748
8.3.3 Polymerase-Ketten-Reaktion (Polymerase
Chain
Reaction, PCR)
··· 750
8.4 Ribonukleinsäuren (RNAs) ··· 758
8.4.1 Isolierung von
RNA
· · · 759
8.4.2 Quantifizierung von
RNA
··· 760
8.5 Rekombinante DNA und
Genanalyse ··· 767
8.5.1 Klonieren ■·· 767
8.5.2 Expressionsvektoren und
Expressionssysteme ··· 770
8.5.3
Transiente
Expression:
Promotor-Analyse ··· 775
8.5.4 Transformationstechniken ··· 775
8.5.5 Sequenzierung von DNA ··· 176
8.6 Klon-Bibliotheken ··· 787
8.6.1 Genom-Bibliotheken ··· 781
Inhaltsverzeichnis
IX
8.6.2
8.6.3
8.6.4
8.6.5
8.6.6
8.6.7
8.6.8
9
9.1
9.2
9.2.1
9.2.2
9.3
9.3.1
9.3.2
9.4
9.4.1
9.4.2
9.5
9.5.1
9.5.2
9.5.3
9.5.4
9.5.5
9.5.6
9.5.7
9.5.8
9.6
9.6.1
cDNA-Bibliotheken ··■ 182
Schnelle Amplifizierung von cDNA-Enden
(rapid
amplification
of cDNA ends;
RACE)
— 186
AlternativeKlonierungsverfahren
··· 186
Expressionsbibliothek ··· 190
Nutzung von Klon-Bibliotheken · · · 190
Physikalische Genkarte
(Physcial Map) ··· 191
DNA-Chip-Technik ··· 193
Proteine
195
Physikalische Eigenschaften ··· 195
Isolierung ··· 196
Aufschluss des Versuchsmaterials · · · 196
Anreicherung ··· 196
Mengenbestimmung
von Gesamtprotein · · · 197
Colorimetrische Methoden ··· 197
Spektroskopische Methoden ··· 198
Reinigung ··· 199
Fällung (Präzipitation)
und Konzentrierung ··· 200
Fraktionierungsverfahren ··· 201
Analyse der Polypeptidstruktur ··· 202
Relative molekulare Masse (Mf) ··· 202
Bestimmung der Primärstruktur:
Sequenzierung ·■· 202
Endgruppen-Bestimmung
nach Sanger ··· 205
Edman-Abbau ··· 205
Massenspektrometrie ··· 208
Analyse C-terminaler Sequenzen · · · 208
Carboxyterminale
Leitersequenzierung ··· 211
Ermittlung möglicher
Sekundärstrukturen ··· 211
Modifizierung von Proteinen ··· 212
Chemische Modifizierung ·■· 212
9.6.2 Affinitätsmarkierung ··· 214
9.6.3 Vernetzung von Proteinen
(Cross-Linking)
■·· 216
9.7 Wechselwirkungen ··· 218
9.7.1 Protein-Protein ··· 218
9.7.2 DNA-Protein ··· 220
9.8 Organisationsebenen der
Proteinstruktur ··· 221
9.9 Peptid- und Proteinsynthese ··■ 222
9.9.1 Chemische Peptidsynthese ··· 222
9.9.2 Translation in vitro · ■ · 223
9.10 Glykoproteine (Proteoglykane) ■·· 225
9.10.1 Erkennen eines Glykoproteins · · · 226
9.10.2 Bestimmung von Glykanen ■·· 226
9.10.3 Isolierung einzelner Glykane · · · 227
9.10.4 Strukturbestimmung von
Glykanen ··· 230
9.11 Enzyme ··· 230
9.11.1 Isolierung und Reinigung · · · 230
9.11.2 Aktivitätsbestimmung ··· 237
9.11.3 Messverfahren ··· 232
9.11.4 Hemmung der Enzymaktivität ··■ 235
io
Immunochemische Verfahren · · · 237
10.1
10.1.1
10.1.2
10.2
10.2.1
10.2.2
10.2.3
10.2.4
10.2.5
10.3
Π
Antikörper ··· 237
Struktur und Eigenschaften · · · 237
Herstellung von Antikörpern ■■· 238
Antigen-Antikörper-Reaktion · · · 242
Immunpräzipitation · · · 243
Immundiffusion ··· 243
Immunfällung ··· 246
Radioimmunoassay (RIA) ··· 246
Festphasen-Immunoassay ··· 247
Immundetektion nach
Blotting
·■· 251
Literatur
253
12 Sachverzeichnis
259
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