Gentechnik, Biotechnik: Lehrbuch und Kompendium für Studium und Praxis ; mit 53 Tabellen
Gespeichert in:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Stuttgart
Wiss. Verl.-Ges.
1999
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| Umfang: | XVI, 632 S. Ill., graph. Darst. |
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Vorwort V
K| Einführung
1.1 Die biologische Revolution ... 3
1.1.1 Die Vorgeschichte zur Gentechnik 3
1.1.2 Die Geschichte der Gentechnik . . 4
1.1.3 Kommerzialisierung der Molekular¬
biologie 5
Zusammenfassung 7
Rfl Prinzipien der Gentechnik
2.1 Die DNA 15
2.1.1 Bau der DNA 15
2.1.2 Denaturierung von DNA 18
2.1.3 Molekülgröße und Form der DNA 19
2.1.4 Superhelikale DNA 20
Zusammenfassung 22
Methoden 1: Elektrophorese .... 23
2.2 Modifizieren von DNA 25
2.2.1 Fragmentierung von DNA 25
2.2.2 Restriktionsendonukleasen 25
Methoden 2:
Physikalische Kartierung 31
2.2.3 Enzymatische Modifikation von
DNA Molekülen 33
2.2.4 Verknüpfen von DNA Fragmenten 38
Zusammenfassung 39
2.3 Polymerase Kettenreaktion
(PCR) 40
2.3.1 Prinzip der PCR Technik 41
2.3.2 Limitation und Effizienz 43
Methoden 3: DNA Synthese .... 48
2.3.3 Modifikationen 47
1
1.2 Biotechnik vs. Gentechnik ... 8
1.2.1 Biotechnik 8
1.2.2 Gentechnik 9
1.2.3 Molekularbiologie, eine inter¬
disziplinäre Wissenschaft 10
Zusammenfassung 11
13
2.3.3.1 „NestedPCR 47
2.3.3.2 „Touch down PCR 51
2.3.3.3 Warmstart PCR 51
2.3.3.4 Verankerte PCR 52
2.3.3.5 Inverse PCR 52
2.3.3.6 Reverse PCR 53
2.3.3.7 Immuno PCR 54
2.3.4 Anwendungen 55
2.3.4.1 Sequenzieren 56
2.3.4.2 Einführen von Mutationen 58
23 A3 Verbinden zweier DNA Fragmente:
„Splicing by overlap extension . . 60
2.3.4.4 Ungerichtete Mutationen durch
Polymerase Kettenreaktion 60
2.3.4.5 Amplifikationen analoger DNA
Bereiche 61
2.3.4.6 Diagnostik 64
Zusammenfassung 64
Methode 4: Sequenzieren von DNA
nach Sanger 65
2.4 Klonieren in Escherichia coii . . 68
2.4.1 DNA Transfersysteme für E. coli . 68
2.4.2 Vektoren für die f. co// Transfor
mation 69
2.4.2.1 Plasmidvektoren 69
2.4.2.2 Phagenvektoren 74
2.4.2.3 Beispiele für gängige Lambda
Vektoren 76
2.4.2.4 M13 Phagen 79
2.4.2.5 Cosmid Vektoren 80
2.4.2.6 „Bacterial artificial chromosomes
(BACs) 82
2.4.2.7 Bakteriophagen P1 Vektoren
(PACs) 83
2.4.3 Konstruktion von Genbanken ... 85
Kfl Mikrobielle Systeme
3.1 Genexpression in Prokaryonten 107
3.1.1 Bakterielle Promotoren 107
3.1.2 DasOperon 109
3.1.3 Die „Shine Dalgarno Sequenz . 109
3.1.4 Die Translation 110
3.1.5 Regulierbare Promotoren 113
3.1.6 Optimierung der Translations
Effizienz 118
3.1.7 Sekretions Systeme 119
3.1.8 Fusionssysteme zur effizienten
Produktreinigung 121
3.1.9 Plasmidstabilisierung 122
3.1.10 Möglichkeiten, rekombinante
Stämme zu stabilisieren 123
Zusammenfassung 125
Methoden 6: Elektrophorese von
Proteinen 126
^J Klonierung in höheren Systemer
4.1 Genexpression in Zeil Linien aus
Säugetieren . . 153
4.1.1 Heterologe Genexpression in
Säugerzellen 156
4.1.1.1 Transiente Expression 156
4.1.1.2 Stabile Expression 159
4.1.2 Zeil Linien aus Säugetieren 159
4.1.3 Selektions Marker 160
4.1.4 Genamplifikation 162
4.1.5 Co und posttranslationale Modi¬
fikationen 163
Zusammenfassung 168
Methoden 8: Autoradiographie . 169
2.4.3.1 Genomische Genbanken 85
2.4.3.2 cDNA Banken 87
2.4.4 Klonierung chemisch syntheti¬
sierter Gene 90
2.4.5 Identifizierung spezifischer Gene 90
2.4.6 Punktmutagenese mit Hilfe synthe¬
tischer Oligonukleotide 96
Zusammenfassung 99
Methode 5: Zentrifugations
methoden 100
107
3.2 Klonieren in Hefe 129
3.2.1 Vektoren in Hefe 131
3.2.1.1 Selektions Marker 131
3.2.1.2 Integrierende Vektoren (Ylp) 133
3.2.1.3 Episomale Plasmide (YEp) 136
3.2.1.4 Autonom replizierende Plasmide
(YRp) 136
3.2.1.5 Zentromere Vektoren (YCp) .... 137
3.2.1.6 Artifizielle Chromosomen (YAC) . 137
3.2.2 Hefe Transformation 139
3.2.3 Homologe Rekombination 140
3.2.4 Genersatz (gene replacement) .. 141
3.2.5 Expression heterologer Proteine . 142
3.2.6 Proteinmodifikation in Hefe .... 146
3.2.7 Andere Hefe Expressions Systeme 148
Zusammenfassung 149
Methoden 7: Protein Blotting ... 150
i 153
4.2 Expressions Vektoren für Tier
zell Systeme 171
4.2.1 Transkriptions Kontrollelemente
höherer Eukaryonten 171
4.2.1.1 Promotoren 171
4.2.1.2 „Enhancer bzw. „Silencer .... 172
4.2.1.3 Transkriptions Terminatoren .... 177
4.2.1.4 Spezialelemente 177
4.2.2 Das SV40 C OS Expressions System 177
4.2.3 BPV Vektoren 178
4.2.4 Das Vaccinia System 179
4.2.5 Das Baculo Virus System 180
4.2.5.1 Baculo Virus Transfer Vektoren .. 181
Zusammenfassung 182
Methoden 9: Der ELISA 183
4.3 Transgenesis 185
4.3.1 Methodenspektrum 186
4.3.1.1 Gentransfer mittels retroviraler
Vektoren 186
4.3.1.2 DNA Mikroinjektionsmethode .. 190
4.3.1.3 Transfektion embryonaler Stamm¬
zellen 191
4.3.2 Transgene Ratten 193
4.3.3 Mikroinjektionstechniken bei
anderen Tieren 193
4.3.4 Auswirkungen fremden geneti¬
schen Materials auf den Wirts¬
organismus 194
4.3.5 Konstitutive Expression fremder
genetischer Information 194
4.3.6 Regulierte Expression fremder
genetischer Information 195
4.3.7 Zerstörung der Genfunktion .... 195
4.3.8 Gezielte Zerstörung von Zellen
durch fremde genetische Infor¬
mation 199
Zusammenfassung 199
4.4 Gentherapie 202
4.4.1 Die erste gentherapeutische Studie 202
4.4.2 Die Gentherapie als Spezialform
der Arzneimitteltherapie 203
4.4.3 Gentherapeutisch behandelbare
Krankheiten 204
4.4.4 Gentherapeutische Konzepte . . . 205
4.4.4.1 Genersatztherapie 205
4.4.4.2 Tumor Vakzinierung 205
4.4.4.3 Sensibilisierung von Zellen für
eine Sekundärtherapie 206
M Zellkultur und Fermentation
5.1 Biologische Wirkstoff¬
produktion 235
5.1.1 Einleitung 235
5.1.2 Biotechnik/Fermentationstechnik 235
5.1.3 Kulturverfahren 237
5.1.4 Der Fermentationsprozeß 243
5.1.5 Chymosin und Käseherstellung . . 244
5.1.6 Shikonin Produktion durch Pflan
zenzellkulturen 247
5.1.7 Synthese von L Ascorbinsäure . . . 247
4.4.5 Möglichkeiten der Aufnahme von
DNA in Zellen 207
4.4.5.1 Direkte Aufnahme nackter DNA . 207
4.4.5.2 Ca Phosphat vermittelte Trans
fektion 208
4.4.5.3 Elektroporation 208
4.4.5.4 Liposomen 209
4.4.5.5 Rezeptor vermittelte Aufnahme
von Adenovirus Polylysin DNA
Komplexen 209
4.4.5.6 Biolistik 210
4.4.5.7 Virus vermittelter Gentransfer .. 211
4.4.6 Kritische Fragen und zu lösende
Probleme 211
Zusammenfassung 212
4.5 Pflanzen Gentechnik 213
4.5.1 Der Beginn der Pflanzen
Gentechnik 213
4.5.2 Agrobakterium 213
4.5.3 Ti und Ri Plasmide 214
4.5.4 Vektoren für die Pflanzenzeil
Transformation 216
4.5.5 Transformation von Pflanzenzellen 217
4.5.6 Monokotyle vs. dikotyle Pflanzen 217
4.5.7 Regulierte Genexpression in
Pflanzen 218
4.5.8 Was wird verändert? 219
4.5.9 Männliche Sterilität 222
4.5.10 Verbesserung der Pflanzenqualität 224
4.5.11 Gentechnisch veränderte Organis¬
men und Allergien 229
4.5.12 Akzeptanzprobleme 231
Zusammenfassung 232
235
5.1.8 Tryptophan Produktion durch
rekombinante f. co// Zellen ... 250
5.1.8.1 Biosynthese von Tryptophan in
E.coli 251
5.1.8.2 Inaktivierung von Regulations¬
mechanismen 252
5.1.8.3 Plasmidstabilität 253
5.1.8.4 Verbesserung der Plasmidstabilität 254
5.1.8.5 Überproduktion von Tryptophan
durch rekombinante E co// Zellen 255
Zusammenfassung 256
s.^ Bioreaktoren 25*
5.2.1 Kultivierung höherer Zellen 26C
5.2.2 Feste Mikrocarrier 26C
5.2.3 Makroporöse Mikrocarrier 261
5.2.4 Aggregatkulturen 261
5.2.5 Zelleinschluß 262
5.2.6 Bioreaktoren für Säugerkulturen . 262
5.2.6.1 Roller bottles 262
5.2.6.2 Reaktoren mit mechanischen
Rührern 262
5.2.6.3 /4/r//ft Reaktoren 263
5.2.6.4 Flüssigbett Reaktoren 264
5.2.6.5 Hohlfaser Bioreaktoren 264
5.2.6.6 Festbett Reaktoren 264
Zusammenfassung 265
5.3 Biotransformationen und
Enzymreaktoren 267
5.3.1 Immobilisierung von Enzymen und
Zellen 268
5.3.2 Biotransformationen in Enzym¬
reaktoren 268
5.3.2.1 Oxidoreduktasen 271
5.3.2.2 Hydrolasen 273
5.3.2.3 Lyasen 276
5.3.2.4 Isomerasen 279
5.3.2.5 Mikroorganismen bei der Auf¬
bereitung von Erzen 280
Zusammenfassung 284
5.4 Isolierung und Aufschluß von
Zellen 285
5.4.1 Zellernte 285
5.4.2 Zellaufschluß 287
Zusammenfassung 288
JM Rekombinante Wirkstoffe
6.1 Die Anforderungen des Euro¬
päischen Arzneibuchs an gen¬
technisch hergestellte Produkte 317
6.1.1 Definition 317
6.1.2 Herstellung 317
6.1.3 Nachweis der Eignung eines Wirt
Vektor Systems zur Herstellung
DNA rekombinanter Produkte .. 318
5.5 Isolierung biologischer Wirk¬
stoffe 289
5.5.1 Extraktion/Fällung 289
5.5.2 Reinigung 290
5.5.2.1 Primäraufarbeitung 291
5.5.2.2 Feinreinigung 291
5.5.2.3 Endreinigung 292
Zusammenfassung 293
5.6 Renaturierung von Proteinen . 294
5.6.1 Die Ausbildung von „inclusion
bodies 296
5.6.2 /n wfro Neufaltung von Proteinen
(Renaturierung) 297
Zusammenfassung 300
Methoden 10: Protein Sequen
zieren 301
5.7 MonoklonaleAntikörper .... 303
5.7.1 Das Problem 304
5.7.2 Die Herstellung monoklonaler
Antikörper 304
5.7.2.1 Immunisierung 305
5.7.2.2 Fusion der Milz Zellen mit
Myelom Zellen 306
5.7.2.3 Selektion fusionierter „Hybridom
Zellen 306
5.7.2.4 Primäres Screening antikörper¬
produzierender Hybridom Zellen . 310
5.7.2.5 Klonierung der vorselektionierten
Zellen 310
5.7.2.6 Identifizierung antikörperprodu¬
zierender Klone 311
5.7.2.7 Charakterisierung der produzierten
Antikörper 311
5.7.3 Rekombinante Antikörper 311
Zusammenfassung 313
317
5.1.3.1 Charakterisierung der Wirtszelle
einschließlich der Herkunft, des
Phänotyps und des Genotyps sowie
der Zellkulturmedien 318
. 1.3.2 Dokumentation der Klonierungs
strategie für das Gen und Charak¬
terisierung des rekombinanten
Vektors 319
6.1.3.3 Charakterisierung des Wirt
Vektor Systems 320
6.1.4 Zellbanksysteme: Validierung und
Kontrolle 320
6.1.5 Validierung des Herstellungs¬
prozesses 322
6.1.5.1 Extraktion und Reinigung 322
6.1.5.2 Charakterisierung des Bulk
produkts und Gleichförmigkeit
der Produktion 323
6.1.6 Identitätsprüfung 323
6.1.7 Reinheitsprüfung 324
6.1.7.1 Chemische Reinheit 324
6.1.7.2 Von Wirtszellen stammende
Proteine 324
6.1.7.3 Aus Wirtszelle oder Vektor stam¬
mende DNA 324
6.1.8 Gehalt und Wirksamkeit 325
6.2.1 Struktur 326
6.2 Biotechnische und gentechni¬
sche Herstellung von Insulin . 326
6.2.2 Insuline aus verschiedenen Tier¬
spezies 326
6.2.3 Umwandlung von Schweine
Insulin in Human Insulin der
Firma Hoechst 328
6.2.4 Die Alternative: Gentechnisch her¬
gestelltes Insulin 328
6.2.5 Insulin Biosynthese 329
6.2.6 Drei Ansätze zur gentechnischen
Insulinherstellung 330
6.2.6.1 Expression der beiden Insulinketten
in unterschiedlichen E co// Stäm
men 330
6.2.6.2 Expression von Proinsulin in E. coli 331
6.2.6.3 Expression von Mini Proinsulin in
S. cerevisiae 332
6.2.7 Insulinvarianten als Alternative her¬
kömmlicher Depotzubereitungen 333
6.2.8 Das erste zugelassene Insulin
Mutein 335
Zusammenfassung 337
6.3 Gentechnisch hergestellte Fibri
nolytika und Antikoagulanzien 338
6.3.1 Fibrinolytika 338
6.3.1.1 Streptokinase 340
6.3.1.2 Urokinase 341
6.3.1.3 Der Gewebe Plasminogen
Aktivator 345
Zusammenfassung/Schlu߬
bemerkung 345
6.3.1.4 r PA (Reteplase), ein gentechnisch
hergestelltes Derivat des Gewebe
Plasminogen Aktivators 352
6.3.2 Antikoagulanzien 356
6.4 Blutgerinnungsfaktoren 359
6.4.1 Gentechnisch hergestellte Faktor
Vlll Präparate 359
Zusammenfassung/Schlu߬
bemerkung 374
6.4.2 Gentechnisch hergestellte Faktor
Vll Präparate 374
Zusammenfassung/Schlu߬
bemerkung 377
6.5 Gentechnisch hergestellte
Erythropoetin Präparate 378
6.6 Rekombinante Hypophysen¬
hormon Präparate 387
6.6.1 Somatropin 387
Zusammenfassung 402
6.6.2 Präparate mit Follikel stimulieren
dem Hormon (FSH) 403
Zusammenfassung/Schlu߬
bemerkung Gonal F® 410
6.7 Desoxyribonuklease 411
Zusammenfassung/Schlu߬
bemerkung Pulmozyme® 414
6.8 Gentechnisch hergestellte ß
Glucocerebrosidase zur Behand¬
lung der Gaucher Krankheit 415
Zusammenfassung/Schlu߬
bemerkung Cerezyme® 422
6.9 Zytokine 424
6.9.1 Interleukine 425
Zusammenfassung/Schlu߬
bemerkung Proleukin® 429
6.9.2 Interferone 430
6.9.2.1 Alpha Interferone 430
Zusammenfassung/Schlu߬
bemerkung Roferon A® 435
Zusammenfassung/Schlu߬
bemerkung Intron A® 436
6.9.2.2 Beta Interferon zur Behandlung
der Multiplen Sklerose 437
Zusammenfassung/Schlu߬
bemerkung Avonex® 44.1
6.9.2.3 Gamma Interferon 441
Zusammenfassung/Schlu߬
bemerkung Imukin® 444
6.9.3 Hämatopoetische Wachstums¬
faktoren 444
Zusammenfassung/Schlu߬
bemerkung Leucomax® 446
Zusammenfassung/Schlu߬
bemerkung Neupogen® 449
Zusammenfassung/Schlu߬
bemerkung Granocyte® 451
6.10 Monoklonale und rekombi
nante Antikörper 452
6.10.1 Orthoclone® OKT3, ein muriner
monoklonaler Antikörper 452
6.10.1.1 Transplantations Immunologie und
Ansatz der immunsuppressiven
Therapie 452
6.10.1.2 Das HLA System („human leuco
cyte antigens ) 453
6.10.1.3 T Zellaktivierung und Abstoßung 455
6.10.1.4 Drei Phasen der Abstoßungs¬
reaktion 457
6.10.1.5 Monoklonale Antikörper bei der
Organtransplantation 457
Zusammenfassung/Schlu߬
bemerkung OKT3® 460
WM Molekulare Diagnostik
7.1 Restriktionsfragment Längen
polymorphismus 487
Zusammenfassung 489
7.2 Kartierung des menschlichen
Genoms 490
7.2.1 /n s/fu Hybridisation 490
7.2.2 Somatische Zellhybride 491
7.2:3 Physikalische Kartierung mit Hilfe
von Restriktionsenzymen 493
6.10.2 Panorex® ein monoklonaler Anti¬
körper zur Behandlung von Kolon /
Rektalkarzinomen 460
6.10.2.1 Adjuvante und palliative Therapie¬
schemata zur Behandlung kolorek
taler Karzinome 460
6.10.2.2 Der Antikörper MoAb17 1A ... 462
6.10.3 ReoPro® (abciximab) ein mono¬
klonaler Antikörper zur Ver¬
meidung ischämischer Komplika¬
tionen 465
6.10.3.1 Biologie der Thrombozyten 466
6.10.3.2 Der GPIIb/llla Rezeptor 467
6.10.3.3 Aktuelle medikamentöse Therapie
zur Verhütung thrombotischer
Komplikationen der PTCA und ihre
Grenzen 468
6.10.3.4 ReoPro® zur Prävention der
Thrombosen 469
Zusammenfassung/Schlu߬
bemerkung ReoPro® 472
6.11 Inhibierende Nukleinsäuren .. 473
6.11.1 Interaktion von Nukleinsäuren mit
Proteinen 473
6.11.2 Inhibierende Nukleinsäuren .... 474
6.11.3 /Anteense Oligonukleotide 474
6.11.4 Katalytische RNA 477
6.11.5 Tripelhelix Bildung 478
6.11.6 Stabilisierung von Nukleinsäuren 480
6.11.7 PNA 481
6.11.8 Bioverfügbarkeit 481
Zusammenfassung 483
487
7.2.4 Überlappende Klonierung 494
Zusammenfassung 497
Methoden 11: Pulsfeld Gel
Elektrophorese 498
7.3 Identifizierung von Genen, die
Erbkrankheiten verursachen . 501
7.3.1 Experimentelle Strategien zur Iden¬
tifizierung krankheitsrelevanter
Gene 501
7.3.2 Funktionelles Klonieren 502
7.3.2.1 Funktionelles Klonieren mit Hilfe
des isolierten Genprodukts 503
7.3.2.2 Funktionelles Klonieren auf der
Basis eines funktionellen Gentests 503
7.3.3 Positionelles Klonieren 504
7.3.3.1 Isolierung des Dystrophin Gens .. 506
7.3.3.2 Isolierung des NF1 Gens 508
7.3.3.3 Isolierung des CF Gens 509
7.3.4 Positionsunabhängiges Klonieren
eines Kandidaten Gens 510
7.3.5 Positionelles Klonieren eines
Kandidaten Gens 511
7.3.5.1 Das Rhodopsin Gen als Kandi¬
daten Gen für die Retinitis pig
mentosa 511
7.3.5.2 Verschiedene Fibrillin Gene als
Kandidaten Gene für verschiedene
Formen des Marfan Syndroms . . 511
7.3.5.3 Entdeckung eines Kandidaten
Gens für das Waardenburg
Syndrom über eine Homologie
zwischen Mensch und Maus .... 511
Zusammenfassung 513
Methoden 12:
Automatisches DNA Sequenzieren 514
7.4 Genetische Erkrankungen .... 516
7.4.1 Autosomal dominante Krank¬
heiten 518
7.4.2 Autosomal rezessive Krankheiten 521
7.4.3 X gekoppelte Krankheiten 523
Zusammenfassung 524
Methoden 13: Sequenzautomaten 525
7.5 Molekulare Krebsdiagnostik. 527
7.5.1 Zytologische Verfahren 527
7.5.2 „Tumormarker 528
7.5.3 Immunologische Verfahren zur
CD Typisierung 529
7.5.4 /n s/fu lmmunverfahren zum Nach¬
weis von Onkogenprodukten . . . 535
7.5.5 Zytogenetische Analysen zum
Nachweis von Aneuploidie und
Onkogen Amplifikationen 536
7.5.6 Nukleinsäurediagnostik 536
7.5.7 DNA Restriktionsfragment Län
genpolymorphismus (RFLP) 537
7.5.8 Nachweis von Punktmutationen
durch RNase Spaltung 539
7.5.9 Nachweis von Punktmutationen
durch Einzelstrang Konformations
polymorphismus Analyse (SSCP) . 539
7.5.10 Nachweis eines Tumor Risikos
durch Verlust einer Heterozygotie 540
7.5.11 Analyse der RNA 541
7.5.12 Expressionsanalyse durch Dot Blot
Verfahren 542
Zusammenfassung 542
Methoden 14:
Durchflußzytometrie 543
7.6 Diagnose von Infektionskrank¬
heiten 544
7.6.1 Virale Infektionen 544
7.6.1.1 Humanes Papillomavirus (HPV) .. 544
7.6.1.2 Herpes Viren 544
7.6.1.3 Hepatitis Viren 545
7.6.1.4 Humanes Immundefizienzvirus
(HIV) 545
7.6.1.5 Humanes T lymphozytotropes
Virus (HTLV) 546
7.6.2 Bakterielle Infektionen 546
7.6.2.1 Infektionen durch Mycobakterium 546
7.6.2.2 Infektionen mit Bonella burg
dorferi 547
7.6.2.3 Bakterien des Gastroi ntestin
altraktes 547
7.6.2.4 Infektionen des Nervensystems . . 547
Zusammenfassung 548
7.7 DNA Charakterisierung in den
forensischen Wissenschaften 549
7.7.1 DNA Fingerprinting 549
7.7.2 Die Methode 551
7.7.3 Interpretation der Daten 552
7.7.4 Datenstatistik 552
7.7.5 Die Polymerase Kettenreaktion . . 553
Zusammenfassung 553
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Inhaltsverzeichnis
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| Signatur: |
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Lageplan |
|---|---|
| Exemplar 1 | Dauerhaft ausgeliehen Ausgeliehen – Rückgabe bis: 31.12.9999 |
Teilbibliothek Weihenstephan
| Signatur: |
1002 CIT 900f 10.1999 B 769
Lageplan |
|---|---|
| Exemplar 1 | Ausleihbar Am Standort |